Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 251/1998 Sb.

Akutní toxické účinky a orgánová nebo systémová toxicita mohou být vyhodnoceny za použití velkého počtu různých testů toxicity (metody B.1 - B.5), ze kterých může být po jediné aplikaci získán předběžný odhad toxicity.

V závislosti na toxicitě látky lze zvolit různé postupy od limitního testu až po kompletní stanovení LD₅₀. Pro inhalační studie není limitní test navržen, protože nebylo možné definovat limitní hodnotu jednorázové inhalační expozice.

Pozornost by měla být věnována metodám, které využívají co nejmenší počet zvířat a minimalizují utrpení zvířete, například metoda pevné dávky (metoda B.1 bis) a metoda stanovení třídy akutní toxicity (metoda B.1 tris). Při testování na jednom druhu může studie na druhém druhu doplnit závěry vyvozené z první studie. V tomto případě může být použita standardní testovací metoda nebo může být použito menšího počtu zvířat.

Testem toxicity s opakovanou aplikací (metody B.7, B.8 a B.9) se posuzují toxické účinky vznikající v důsledku opakované expozice. Důležité je klinické pozorování zvířat tak, aby se získalo co nejvíce informací. Tyto testy by měly pomoci zjistit cílové orgány toxicity a toxické a netoxické dávky. Od dlouhodobých studií se vyžaduje zkoumání těchto aspektů do větší hloubky (metody B.26 - B.30 a B.33).

Mutagenita se vztahuje k indukci trvalých přenosných změn v množství nebo struktuře genetického materiálu buněk nebo organismů. Tyto změny („mutace“) mohou postihnout jediný gen nebo segmenty genů, blok genů nebo celé chromozómy. Účinky na celé chromozómy se mohou projevovat změnou jejich struktury nebo počtu.

Mutagenní aktivita látky se stanoví testy in vitro na genové (bodové) mutace v baktériích (metoda B.13/14) anebo na strukturální chromozómové aberace v savčích buňkách (metoda B.10).

Přijatelné jsou také postupy in vivo, např. micronucleus test (metoda B.12) nebo analýza metafáze chromozomů kostní dřeně (metoda B.11). Je však třeba dávat jednoznačně přednost in vitro metodám, pokud nejsou kontraindikovány.

Pro látky vyráběné ve velkém množství nebo pro stanovení a kontrolu rizika mohou být vyžadovány ještě další studie ke zjištění mutagenity nebo k předběžnému vyšetření na karcinogenitu. Tyto studie lze využít k několika účelům: potvrzení výsledků získaných základním souborem testů; zkoumání účinků nezachycených základním souborem metod; zahájení nebo rozšíření studií in vivo.

Pro tyto účely zahrnují metody B.15 až B.25 jak eukaryontní systémy in vivo a in vitro, tak rozšiřují rozsah biologických účinků. Tyto testy poskytují informace o bodových mutacích a jiných účincích v organismech složitějších než baktérie používané v základním souboru testů.

Obecně platí, že další uvažované studie mutagenity je třeba naplánovat tak, aby poskytly relevantní doplňující informace o mutagenním, případně karcinogenním potenciálu testované látky.

Konkrétní studie, vhodná pro daný případ, bude záviset na četných faktorech, včetně chemické a fyzikální charakteristiky látky, výsledků základních bakteriálních a cytogenetických testů, metabolického profilu látky, výsledků dalších testů toxicity a známých způsobů použití látky.

Pro posuzování rizika dědičných účinků u savců jsou k dispozici metody na detekci dědičných účinků v celém savčím organizmu, ať už vyvolaných genovými (bodovými) mutacemi, např. specifický locus test u myší detekující mutace zárodečné buňky v první generaci (nezahrnuto v této příloze), nebo chromozómovými aberacemi, např. test na přenosné translokace u myší (metoda B.25). Těchto metod lze použít při odhadování možného genetického rizika látky pro člověka. Vzhledem ke složitosti těchto testů a velmi velkému počtu potřebných zvířat, zvláště pro specifický locus test, je třeba se rozhodovat pro takovou studii jen na základě závažných důvodů.

Při stanovení genotoxicity se postupuje podle standardního metodického protokolu vypracovaného pro danou metodiku po projednání s Národní referenční laboratoří genetické toxikologie.

Chemické látky mohou být charakterizovány jako genotoxické nebo negenotoxické karcinogeny, v závislosti na předpokládaném mechanismu působení.

Předběžné informace o genotoxickém karcinogenním potenciálu látky se čerpají ze studií mutagenity/genotoxicity. Další informace poskytují testy toxicity při opakované aplikaci a testy subchronické nebo chronické toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci, metoda B.7, a dlouhodobější studie s opakovaným podáváním zahrnují posouzení takových histopatologických změn, např. hyperplazie v určitých tkáních, které by mohly být také významné. Tyto studie a toxikokinetické informace mohou pomoci identifikovat chemické látky s karcinogenním potenciálem, které vyžadují další, podrobnější zkoumání tohoto aspektu pomocí testu karcinogenity (metoda B.32) nebo často v kombinované studii chronické toxicity/karcinogenity (metoda B.33).

K dispozici jsou rovněž testy transformace buněk savců, které určují schopnost látky vyvolat takové morfologické změny a změny chování buněčných kultur, u kterých se předpokládá souvislost s maligní transformací - in vivo (metoda B.21). Používá se několika různých buněčných typů a kritérií pro transformaci.

Reprodukční toxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle zhoršení reprodukčních funkcí nebo schopností samců a samic (vliv na plodnost) nebo podle nedědičných škodlivých účinků na potomstvo (vývojová toxicita) zahrnující také teratogenitu a účinky v průběhu laktace.

Testovací metoda (metoda B.31) pro studie zaměřené na teratogenitu jako součást vývojové toxicity počítá hlavně s orálním podáváním. Alternativně mohou být použity jiné způsoby aplikace v závislosti na fyzikálních vlastnostech testované látky nebo podle pravděpodobného způsobu expozice člověka. V takových případech je třeba testovací metodu vhodně upravit.

Pokud je vyžadován třígenerační reprodukční test je možno popisovanou metodu pro dvougenerační reprodukční test (metoda B.35) rozšířit tak, aby pokryl třetí generaci.

Neurotoxicita se zjišťuje různými způsoby, např. podle funkčních změn nebo strukturních a biochemických změn v centrálním nebo periferním nervovém systému. Předběžné upozornění na neurotoxicitu může vzejít z testů akutní toxicity. Test toxicity při opakované aplikaci (metoda B.7) zahrnuje také posouzení neurotoxického účinku. Metoda by měla pomoci odhalit chemické látky s neurotoxickým potenciálem, které vyžadují další, hloubkové zkoumání tohoto aspektu. Navíc je důležité vzít v úvahu specifické neurotoxické účinky, které nemohou být odhaleny v jiných studiích toxicity. Bylo například zjištěno, že jisté organické sloučeniny fosforu způsobují pozdní toxicitu, která je posuzována metodami B.37 a B.38 po jednorázovém nebo opakovaném podání látky.

Imunotoxicita se zjišťuje různými způsoby, například podle imunosuprese anebo podle zvětšení odpovědi imunitního systému, které má za následek buď hypersensitivitu nebo navozenou autoimunitu. Test toxicity při opakované aplikaci (metoda B.7), zahrnuje stanovení imunotoxických účinků. Metoda by měla pomoci odhalit chemické látky s imunotoxickým potenciálem, vyžadující další, hloubkové zkoumání tohoto aspektu.

Toxikokinetické studie pomáhají při interpretaci a vyhodnocení údajů o toxicitě, objasňují specifické aspekty toxicity testované chemické látky a výsledky mohou pomoci při návrhu dalších studií toxicity. Nepředpokládá se, že bude v každém případě zapotřebí stanovit všechny parametry. Pouze v ojedinělých případech bude nezbytná celá posloupnost toxikokinetických studií (studie absorpce, distribuce, metabolismu a exkrece). U některých sloučenin mohou být vhodné změny v této sekvenci nebo se může ukázat jako dostatečná studie s jednorázovým podáním (metoda B.36).

Informace o chemické struktuře a fyzikálně-chemických vlastnostech mohou také poskytnout údaje, umožňující odhad charakteristik absorpce při plánovaném způsobu aplikace, metabolismu a distribuce do tkání. Přispět mohou také informace o toxikokinetických parametrech z předcházejících toxikologických a toxikokinetických studií.

Složení testované látky, včetně významnějších nečistot, a její relevantní fyzikálně-chemické vlastnosti včetně stability je třeba znát před zahájením jakékoli toxikologické studie.

Fyzikálně-chemické vlastnosti testované látky poskytují informace důležité pro výběr způsobu podávání, pro návrh konkrétní studie a pro manipulaci s látkou a její skladování.

Vypracování analytické metody pro kvalitativní a kvantitativní stanovení testované látky (a také pokud možno větších nečistot) v dávkovacím médiu a biologickém materiálu by měl předcházet zahájení studie.

Všechny informace týkající se identifikace, fyzikálně-chemických vlastností, čistoty a chování testované látky mají být zahrnuty v závěrečné zprávě o testu.

Pro toxikologické testy je přísná kontrola podmínek prostředí, ve kterém jsou zvířata chována, a správná péče o zvířata podstatnou podmínkou.

Životní podmínky v prostorech pro pokusná zvířata je třeba přizpůsobit jednotlivým druhům. Pro potkany, myši a morčata je vhodná teplota místnosti 22 °C ± 3 °C při relativní vlhkosti vzduchu 30 - 70 %; pro králíky má být teplota 20 °C ± 3 °C při relativní vlhkosti vzduchu 30 - 70 %.

Některé experimentální techniky výzkumu jsou zvláště citlivé na teplotu. Pro tyto případy jsou podrobnosti o příslušných podmínkách uvedeny v popisu testované metody. Při všech zkouškách toxických účinků je třeba sledovat teplotu a vlhkost vzduchu, zaznamenávat je a uvést je v závěrečné zprávě o průběhu pokusu.

Osvětlení má být umělé se střídáním světla a tmy po dvanácti hodinách. Podrobnosti týkající se osvětlení je třeba zaznamenat a uvést ve zprávě o průběhu pokusu.

Pokud metoda nevyžaduje jiný způsob, mohou být zvířata chována jednotlivě nebo v malých skupinách jedinců jednoho pohlaví, ne více než 5 zvířat v jedné kleci.

Podstatnou součástí zprávy o pokusech na zvířatech jsou údaje o způsobu chovu v klecích a počtu zvířat chovaných v jedné kleci jak během expozice sledované látce, tak během následující doby pozorování.

Krmení musí vyhovovat všem požadavkům výživy pro příslušný použitý živočišný druh. Podávají-li se zvířatům studované látky v potravě, může se výživová hodnota snížit vzájemným působením studované látky a některé složky potravy. Možnost takové reakce je nutno vzít v úvahu při interpretaci výsledků. Používají se konvenční laboratorní diety s neomezeným přístupem k pitné vodě. Pokud je testovaná látka podávána v potravě, je třeba tomu přizpůsobit výběr diety.

Příměsi v potravě, které mají prokazatelně vliv na toxicitu, nesmějí být přítomny v koncentracích, ve kterých by se tento vliv projevil.

Při vypracování testovacích metod musí být věnována potřebná pozornost ochraně zvířat.

Snížení počtu a omezení bolesti a stresu zvířat lze dosáhnou např. použitím metody fixní dávky (B.1.bis) nebo metody stanovení třídy akutní toxicity (B.1.tris). Metoda s pevnou dávkou nevyužívá smrti jako specifického kritéria a vyžaduje menší počet zvířat. Metoda stanovení třídy akutní toxicity vyžaduje v průměru o 70 % zvířat méně než metoda B.1.

Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu je třeba humánním způsobem utratit; testované látky se nesmějí podávat v takových dávkách a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a stres následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.

Použití limitních testů, nejen v testech akutní toxicity (metody B.1, B.2 a B.3), ale také v in vivo testech mutagenity (metody B.11 a B.12), dovoluje vyhnout se testování zbytečně velkými dávkami.

Při testování dráždivosti je možné test neprovést nebo jej omezit na studii u jednoho zvířete, je-li to dostatečně vědecky zdůvodnitelné. Takové vědecké zdůvodnění může být založeno na fyzikálně-chemických vlastnostech látky, na výsledcích jiných již provedených testů nebo na výsledcích dobře validizovaných testů in vitro. Například, byla-li s látkou provedena studie akutní kožní toxicity s dávkou používanou v limitním testu (metoda B.3) a nebylo-li pozorováno žádné podráždění kůže, další testování kožní dráždivosti (metoda B.4) může být zbytečné; látky, které prokazatelně vyvolaly poleptání nebo silné podráždění kůže při studii kožní dráždivosti (metoda B.4), nesmějí být dále testovány na dráždění oka.

Je nutno neustále vyvíjet a ověřovat alternativní postupy, které mohou poskytovat stejnou úroveň informací jako současné testy na zvířatech a budou přitom využívat menšího počtu zvířat, budou působit méně utrpení nebo se úplně obejdou bez používání zvířat.

Pokud budou takové metody k dispozici, musí být jejich použití pro charakterizování rizika, následnou klasifikaci a označování látky podle nebezpečnosti bráno v úvahu všude tam, kde je to možné.

Při hodnocení a interpretaci pokusů na zvířatech a testů in vitro je nutno mít na zřeteli, že přímá extrapolace na člověka je možná jen v omezené míře; doklady o nepříznivých účincích u lidí, pokud jsou k dispozici, mohou sloužit k ověření výsledků testování.

Výsledky testování mohou být použity pro klasifikaci a označování nových i stávajících látek podle účinků na zdraví člověka na základě vlastností zjištěných a kvantifikovaných těmito metodami.

Tyto výsledky mohou být také použity pro studie, zaměřené na posuzování rizika nových i stávajících látek.

Testovaná látka se podává v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat orálně sondou, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Zvolené dávky je možno stanovit podle výsledků orientačního testu. Registrují se pozorované účinky a uhynutí. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají. Tato metoda se používá především při pokusech na hlodavcích.

Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nesmějí podávat v takových dávkách a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a stres následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.

Pokud je třeba, připraví se roztok nebo suspenze testované látky ve vhodném vehikulu. Doporučuje se jako první uvážit použití vodného roztoku, další volbou je roztok v rostlinném oleji, teprve potom jako další možnost roztok v jiných vhodných vehikulích nebo suspenze. U nevodných vehikulí musí být známy nebo určeny před testem nebo během něho jejich relevantní toxikologické vlastnosti. U hlodavců by objem neměl normálně překročit 10 ml.kg^-1 tělesné hmotnosti; výjimkou jsou vodné roztoky, jichž je možno podávat až 20 ml.kg^-1. Variabilita objemů látky podávané v testech by se měla minimalizovat takovou úpravou koncentrací, aby se zajistil konstantní objem na všech hladinách dávek. Současně je třeba zvolit vhodnou koncentraci látky ve vehikulu tak, aby bylo minimalizováno lokální dráždivé působení.

Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Je třeba používat mladých zdravých zvířat z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku testu by u obou pohlaví nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.

Pro každou hladinu dávek použít nejméně 5 hlodavců stejného pohlaví. Používá-li se samic, musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud je k dispozici informace, že jedno z obou pohlaví je výrazně citlivější, je třeba používat zvířata tohoto pohlaví.

Má být dostatečný počet hladin dávek, nejméně tři, a mají být vhodně odstupňovány tak, aby byl u testovacích skupin viditelný rozsah toxických účinků a mortality. Získané údaje musí stačit na znázornění vztahu mezi dávkou a účinkem, a pokud je to možné, musí umožnit stanovení LD₅₀ s přijatelnou spolehlivostí.

S použitím hlodavců lze provést limitní test jednou dávkou nejméně 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti na skupinách 5 samců a 5 samic s použitím výše popsaných postupů. Pokud podaná látka způsobí uhynutí, je třeba uvážit provedení úplné studie.

Doba pozorování by měla činit nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit rigorózně. Měla by být určena podle obrazu otravy, rychlosti vývoje otravy a trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Důležitá je doba, kdy se projevy otravy objeví a vymizí, a doba do uhynutí, zvláště tam, kde je patrná tendence k zpožděné mortalitě.

Před podáním testované látky mají být zvířata hladová. Potkanům se potrava odebere večer před testem. U zvířat s vyšší rychlostí látkové výměny postačí kratší hladovění; přístup k pitné vodě není omezen. V den pokusu se zvířata zváží a testovaná látka se podá sondou orálně v jedné dávce. Není-li možno podat dávku najednou, lze podat aplikovanou dávku po menších množstvích během nejvýše 24 hodin. Po podání dávky je třeba zamezit přístup k potravě ještě 3 - 4 hodiny. Podává-li se látka frakcionovaně během určitého období, může být žádoucí - podle délky tohoto období - potravu a vodu zvířatům poskytnout.

Po podání látky se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky, pro každé zvíře se vedou samostatné záznamy. Během prvního dne je třeba provádět častá pozorování. Je nezbytné sledovat a zaznamenat místní účinek aplikované látky a bezprostřední reakci zvířat na aplikaci.

Nejméně jednou během každého pracovního dne je třeba provádět pečlivá klinická vyšetření. Jiná pozorování se provádějí denně s vhodnými opatřeními k minimalizaci ztrát zvířat pro studii, např. pitva nebo zmrazení uhynulých zvířat, a izolace či usmrcení slabých nebo umírajících zvířat. Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu. Okamžik uhynutí je třeba zaznamenat co nejpřesněji.

Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí až do konce pokusu, se pitvají. Všechny patologické nálezy se zaznamenají. Je-li to indikováno, odeberou se tkáně pro histologické vyšetření.

Po dokončení pokusu na jednom pohlaví, podá se látka nejméně jedné skupině o pěti zvířatech druhého pohlaví s cílem zjistit, zda zvířata druhého pohlaví nejsou výrazně citlivější na testovanou látku. V jednotlivých případech může být odůvodněno použití menšího počtu zvířat. Pokud je k dispozici spolehlivá informace, že zvířata testovaného pohlaví jsou výrazně citlivější, testování na zvířatech druhého pohlaví je možno vynechat.

Údaje se sestavují do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu, doba uhynutí jednotlivých zvířat, počet zvířat s jinými projevy otravy, popis toxických účinků a pitevních nálezů. Stanovení hmotnosti jednotlivých zvířat se provede bezprostředně před podáním testované látky, pak v týdenních intervalech a v době uhynutí. Změny hmotnosti je třeba stanovit a zaznamenat, přežívají-li zvířata déle než jeden den. Zvířata, která byla humánním způsobem utracena s ohledem na stres a bolest vyvolané podanou látkou, se zaznamenávají jako uhynutí vyvolané touto látkou. LD₅₀ se vypočte uznávanou metodou. Vyhodnocení údajů by mělo zahrnovat také vztah, pokud existuje, mezi expozicí zvířat testované látce a výskytem a stupněm všech abnormalit včetně změn chování, klinických symptomů, makroskopických lézí, změn tělesné hmotnosti, mortality a ostatních toxických účinků.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

Test akutní orální toxicity poskytuje informace o nepříznivých účincích, které mohou následovat během krátké doby po orálním podání jedné dávky testované látky.

Metoda s fixní dávkou se provádí ve dvou etapách.

V předběžné orientační studii se sekvenčním způsobem sledují účinky několika dávek při orální aplikaci sondou u zvířat téhož pohlaví, vždy jedno zvíře na dávku. Orientační studie poskytuje informaci o vztahu dávky a toxicity, včetně odhadu minimální letální dávky. Normálně se v této první etapě nepoužije víc než pěti zvířat.

V hlavní studii se látka podává orálně sondou skupinám pěti samců a pěti samic v jedné z těchto fixních dávek: 5, 50, 500 nebo 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti. Použitá dávka se odvodí z předběžné orientační studie, a to jako dávka, která pravděpodobně vyvolá “zřejmou toxicitu“ (viz část B - Všeobecný úvod bod 1.2), ale ne uhynutí.

Po podání se pozorují účinky. Jestliže vybraná výchozí úroveň dávky vyvolá zřejmou toxicitu, ale žádnou mortalitu, není třeba žádné další testování. Když na zvolené úrovni dávky není pozorována zřejmá toxicita, látka se znova otestuje na nejbližší vyšší úrovni dávky. Pokud zvířata uhynou nebo když závažná toxická reakce vyžaduje humánní utracení, látka se znova otestuje na nejbližší nižší úrovni dávky.

Tento postup umožňuje zjistit “diskriminující dávku“ (viz část B - Všeobecný úvod bod 1.2), tj. nejvyšší z předem stanovených úrovní dávky, kterou je možno podat aniž by došlo k úhynu (včetně případů humánního utracení).

Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nesmějí podávat v takových dávkach a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a stres následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.

Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu.

Je třeba používat běžně užívané kmeny pokusných zvířat. Na začátku testu by u obou pohlaví nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin orientační studie a hlavní studie. Běžně stačí pro hlavní studii jedna skupina každého z obou pohlaví.

Pokud je třeba, připraví se roztok nebo suspenze testované látky ve vhodném vehikulu. Doporučuje se jako první uvážit použití vodného roztoku, další volbou je roztok v rostlinném oleji, teprve potom jako další možnost roztok v jiných vhodných vehikulích nebo suspenze. U nevodných vehikulí musí být známy nebo určeny před testem nebo během něho jejich relevantní toxikologické vlastnosti. U hlodavců by objem neměl normálně překročit 10 ml.kg^-1 tělesné hmotnosti; výjimkou jsou vodné roztoky, jichž je možno podávat až 20 ml.kg^-1. Variabilita objemů látky podávané v testech by se měla minimalizovat takovou úpravou koncentrací, aby se zajistil konstantní objem na všech hladinách dávek.

Před podáním testované látky mají být zvířata hladová. Potkanům se potrava odebere večer před testem; přístup k pitné vodě není omezen. V den pokusu se zvířata zváží a testovaná látka se podá sondou orálně v jediné dávce. Není-li možno podat dávku najednou, lze podat aplikovanou dávku po menších množstvích během nejvýše 24 hodin. Po podání dávky je třeba zamezit přístup k potravě ještě 3 - 4 hodiny. Podává-li se látka frakcionovaně během určitého období, může být žádoucí - podle délky tohoto období - potravu a vodu zvířatům poskytnout.

Vyšetřují se účinky různých dávek na jednotlivá zvířata. Normálně se používají samice, pokud nejsou k dipozici údaje, že jsou samci citlivějším pohlavím. Dávky se podávají sekvenčně, čeká se alespoň 24 hodin před podáním dávky dalšímu zvířeti. Všechna zvířata se pečlivě pozorují s cílem zjistit projevy otravy nejméně po sedm dní; pokud přetrvávají projevy mírné otravy sedmý den, zvíře se musí pozorovat ještě po dalších sedm dní. Posuzují se následující výchozí hladiny dávek: 5, 50, 500 a 2000 mg.kg^-1. Jestliže zvolená výchozí dávka nevyvolá těžkou otravu a přitom nejbližší vyšší vyvolá uhynutí, potom je nutné podat podle potřeby jednu nebo více vmezeřených úrovní dávek. Tento způsob by měl poskytnout informace o úrovni(ích) dávek, která(é) vyvolává(vají) příznaky otravy a o nejmenší dávce, která vyvolává mortalitu.

Je třeba pokusit se vybrat výchozí dávku podle údajů o příbuzných chemických látkách. Pokud nejsou k dispozici, doporučuje se použít jako první dávky 500 mg.kg^-1. Jesliže se po výchozí dávce nepozorují příznaky otravy, vyšetřuje se další vyšší úroveň dávky. Jestliže nedojde k uhynutí při 2000 mg.kg^-1, je orientační studie skončena a hlavní studii je třeba provést na této úrovni dávky. Jestliže jsou při použití výchozí dávky (např. 500 mg.kg^-1) zjištěny těžké účinky, vyžadující humánní utracení, je podána dalšímu zvířeti nejbližší nižší dávka (např. 50 mg.kg-1). Jestliže toto zvíře přežívá, mohou být použity pro další zvířata vhodné dávky mezi určenými fixními dávkami. Za normálních podmínek se neočekává, že je při tomto postupu zapotřebí více než 5 zvířat.

Pro každou vyšetřovanou dávkovou hladinu by se mělo použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Samice by měly být nullipary a neměly by být březí.

Principem metody fixní dávky je použití pouze mírně toxických dávek pro hlavní studii. Je třeba se vyhnout podávání letálních dávek testované látky.

Dávka, která bude užita v testu, má být zvolena z jedné ze 4 fixních úrovní dávek, jmenovitě 5, 50, 500 nebo 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti. Zvolená výchozí úroveň dávky by měla být ta, která pravděpodobně vyvolá zřejmou toxicitu, avšak nikoliv mortalitu (včetně utracení z humánních důvodů); náhodná uhynutí nejsou zahrnuta, ale mají být zaznamenána. Jestliže tato dávka vyvolá zřejmou toxicitu, ale nevyvolá mortalitu, není zapotřebí dalšího testování.

Když podání zvolené dávky nevyvolá zřejmou toxicitu, je nutné látku znovu testovat na další vyšší úrovni dávek. Zvířata by však měla být dále pozorována tak, aby pozorovací období bylo kompletní. Jestliže těžká toxická odpověď vyžaduje humánní utracení zvířat nebo když se projeví mortalita vlivem látky, měla by být látka znovu testována na další nižší úrovni dávek. Opět ta zvířata, která není nutné humánně utratit, by měla být pozorována po celé pozorovací období.

Po podání látky se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky. Pro každé zvíře se vedou samostatné záznamy. Je nezbytné sledovat a zaznamenat místní účinek aplikované látky a bezprostřední reakci zvířat na aplikaci.

Doba pozorování by měla být nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit rigorozně. Měla by být určena podle obrazu otravy, rychlosti vývoje otravy a trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Důležitá je doba, kdy se projevy otravy projeví a vymizí a doba do uhynutí, zvláště tam, kde je patrná tendence k pozdnímu vzniku toxických příznaků.

Pečlivá klinická vyšetření je třeba provádět nejméně dvakrát první den po podání látky a nejméně jedenkrát za den další dny. Zvířata vykazující patrné známky bolesti nebo výrazné příznaky stresu je třeba humánně utratit. Častější pozorování jsou prováděna během několika prvních dní po podání látky, jestliže zvířata dále vykazují příznaky toxicity. Test může být ukončen v případě, když je zřejmé, že byla zvolena příliš vysoká dávka.

Pozorování se zaměřuje na změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu.

Stanovení hmotnosti jednotlivých zvířat se provede bezprostředně před podáním testované látky, denně po další 3 dny a potom jednou týdně. Zvířata, která uhynou během testu, i ta, která přežívají do konce testu, se zváží a pitvají. Všechny makroskopické patologické změny se zaznamenávají. Je-li to indikováno, odeberou se tkáně pro histopatologické vyšetření.

V závislosti na účincích předcházející úrovně dávky může být zapotřebí vyšetření druhé nebo výjimečné třetí hladiny dávky.

V případě,že látka vyvolává mortalitu při dávce 5 mg.kg^-1 (nebo jestliže orientační studie naznačuje mortalitu při této dávce), je třeba dále vyšetřovat akutní toxicitu testované látky.

Údaje z orientační i hlavní studie se sestavují do tabulky jednotlivě pro každou testovanou úroveň dávky. Z ní musí být patrný počet zvířat na počátku pokusu; počet zvířat s příznaky toxicity; počet zvířat uhynulých během testu nebo utracených z humánních důvodů; popis toxických účinků; pro hlavní studii, zda byl pozorován zřejmý toxický účinek, který lze připsat testované látce; časový průběh všech toxických účinků; výsledky pitvy. V případě, že zvířata přežívají déle než den, je třeba vypočítat a zaznamenat změny hmotnosti.

Zvířata, která jsou humánně utracena vzhledem ke stresu nebo bolestem vyvolaným testovanou látkou, jsou zaznamenána jako uhynutí vyvolaná testovanou látkou.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace pro orientační i hlavní studii:

Metoda stanovení třídy akutní toxicity poskytuje informace jak pro posuzování rizika, tak pro účely klasifikace rizika.

Metoda používá tří pevně stanovených dávek v přiměřených odstupech, tak aby bylo možno testovanou látku na základě výsledků zařadit. Kromě toho postup popsaný pro tuto testovací metodu umožňuje výběr tří doplňkových pevně stanovených dávek, které lze použít buď jako alternativní dávky pro určité body rozhodovacího procesu, nebo pro další testování. Použití některé z těchto doplňkových dávek je možno uvážit, pokud je žádoucí nebo nezbytné další zpřesnění.

Metoda používá pevně stanovené počáteční dávky a není určena pro výpočet přesné LD₅₀. Umožňuje stanovení rozsahu expozic, ve kterém se očekává úmrtnost, protože smrt části zvířat je i u této metody hlavním kritériem účinku. Výsledky testu mají umožnit klasifikaci látky. Vzhledem k sekvenčnímu postupu by trvání testu mohlo být delší než postup popsaný v metodě B.l. Hlavní výhodou této metody je menší spotřeba zvířat než u metody akutní toxicity (orální) (B. 1) i než u alternativní metody fixní dávky (B. l bis).

Látka se podává orálně skupině pokusných zvířat v jedné ze stanovených dávek. Testování se provádí postupně, v každém kroku se používají tři zvířata stejného pohlaví. Není nutné provádět předběžnou studii. Přítomnost nebo nepřítomnost úhynu zvířat ve vztahu k podávané látce rozhodne o dalším kroku, t.j.

Zdravá mladá dospělá zvířata jsou náhodně vybrána, označena tak, aby byla možná identifikace jednotlivých zvířat, a chována ve svých klecích nejméně 5 dnů před zahájením testu, aby si mohla zvyknout na laboratorní podmínky. Zvířata mohou být v klecích ve skupinách podle pohlaví a dávky, ale počet zvířat v jedné kleci musí umožnit jasné pozorování každého zvířete.

Testovaná látka je aplikována zvířatům v jediné dávce žaludeční sondou nebo vhodnou kanylou.

Pokud je to třeba, testovaná látka se rozpustí nebo suspenduje ve vhodném nosiči. Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku/suspenze, pak použití roztoku/emulze v jedlém rostinném oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiných nosičích. Pro nevodná vehikula musí být známa jejich toxická charakteristika; pokud není známa, musí být stanovena ještě před testem.

Zvířata jsou před aplikováním látky po určitou dobu bez potravy (např. potkani přes noc a myši 3 - 4 hodiny); přístup k vodě se neomezuje.

Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Samice musí být nullipary a nesmí být březí.

Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.

Pro každý krok se používají tři zvířata jednoho pohlaví. V úvodním kroku může být použito kterékoli pohlaví.

Výchozí dávková úroveň je vybrána ze tří pevných úrovní, t. zn. 25, 200 a 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti. Výchozí úroveň dávky by měla být taková, aby s největší pravděpodobností způsobila uhynutí alespoň některých zvířat, jimž byla látka podána. V závislosti na výchozí dávce se použije příslušného diagramu postupu popsaného v Dodatku 1.

Pro výběr pohlaví a výchozí dávky je třeba využít veškeré dostupné informace, včetně informací o vztahu struktury a účinku. Pokud tyto informace naznačují, že úmrtnost je nepravděpodobná i při nejvyšší úrovni dávky (2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti), pak se provede limitní test. Kde nejsou žádné informace o testované látce, doporučuje se - s ohledem na pokusná zvířata - použít výchozí dávku 200 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti.

V některých případech je třeba dále zpřesnit získanou informaci, než jak to dovoluje test s třemi pevnými dávkovými úrovněmi ve výši 25, 200 a 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti. V těchto případech se může uvažovat o dalším testování při doplňkových pevných dávkách ve výši 5, 50 nebo 500 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti.

Nemají se aplikovat dávky, o kterých je známo, že způsobují svými leptavými nebo těžce dráždícími účinky značnou bolest a stres.

Časový interval mezi aplikačními skupinami je závislý na rychlosti nástupu, na trvání a závažnosti toxických příznaků. Testování na zvířatech druhého pohlaví nebo při další dávce je třeba odložit, dokud není jisté, že zvířata předchozí dávku přežila.

Limitní test s jedinou úrovní dávky ve výši 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti se provádí na třech zvířatech každého pohlaví. Pokud dojde k uhynutí souvisejícím s podáním látky, lze další testování provést při dávkách 200 mg.kg^-1 (nebo 500 mg.kg^-1 ) tělesné hmotnosti.

Přežívající zvířata je třeba pozorovat obvykle po dobu 14 dnů, kromě případů, kdy musí být zvířata vyloučena z dalšího pozorování a humánně utracena z důvodů ochrany zvířat. Trvání pozorování by však nemělo být stanoveno předem pevně; může být prodlouženo podle toxických reakcí, doby jejich nástupu a délky zotavovacího období. Je důležité zaznamenávat dobu, kdy se objeví a mizí příznaky toxicity, zvláště jde-li o zpožděné toxické příznaky. Veškerá pozorování jsou systematicky zaznamenávána: záznamy jsou vedeny pro každé jednotlivé zvíře.

Po období hladovění jsou zvířata před podáním zkušební látky zvážena. Po aplikaci látky jsou zvířata bez potravy po dobu dalších 3 - 4 hodin. Kde je dávka podávána po částech během určité doby, může být - v závislosti na délce této doby - nezbytné poskytnout zvířatům potravu i vodu.

Maximální objem tekutiny, který může být podán najednou, závisí na velikosti zvířete. U hlodavců by objem neměl normálně přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, v případě vodných roztoků lze podat i 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Rozdíly v podávaném objemu je třeba minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl podáván týž objem na všech úrovních dávky. Jestliže není možné podat dávku celou najednou, je možné ji aplikovat po částech po dobu nepřekračující 24 hodin.

Podrobnosti postupu testování jsou popsány v Dodatku 1.

Pečlivé klinické pozorování se provádí dvakrát za první den (den aplikace) nebo častěji, pokud to vyžaduje reakce zvířat na podání látky, a dále nejméně jednou denně. Zvířata, která jsou nalezena v agonálním stavu, nebo zvířata vykazující příznaky silné bolesti a přetrvávajícího silného stresu, je třeba humánně utratit: tato zvířata jsou hodnocena stejně jako jako zvířata uhynulá.

Ať už byla zvířata utracena z humánních důvodů nebo byla nalezena mrtvá, dobu smrti je třeba zaznamenat co nejpřesněji. Další pozorování se provádí, dokud zvířata vykazují příznaky toxicity. Pozorování zahrnuje změny na kůži a srsti, na očích a sliznicích, a také na dýchacím, oběhovém, vegetativním a centrálním nervovém systému, motorické aktivitě a chování. Pozornost je třeba věnovat výskytu třesu, křečí, slinění, průjmu, letargie, spánku a kómatu.

Veškerá pozorování jsou systematicky zaznamenávána: záznamy jsou vedeny pro každé jednotlivé zvíře.

Všechna zvířata jsou zvážena krátce před podáním testované látky a pak nejméně jednou týdně. Počítají se a zaznamenávají změny hmotnosti. Na konci testu jsou přežívající zvířata zvážena před tím, než budou humánně utracena.

U všech zvířat použitých ve studii, včetně uhynulých a utracených během testu, se provede pitva. Všechny makroskopické patologické změny jsou zaznamenány pro každé zvíře zvlášť. Pro získání dalších užitečných informací je možno uvážit mikroskopické vyšetření orgánů vykazujících známky makroskopické patologie u zvířat přežívajících 24 a více hodin.

K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Navíc jsou všechny údaje shrnuty do tabulkové formy, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úmrtí jednotlivých zvířat, popis, časový průběh a vratnost toxických účinků, a pitevní nálezy.

Všeobecné poučení o interpretaci výsledků pro klasifikaci je uvedeno v Dodatku 2.

Tato metoda je analogická s metodou OECD TG 423.

V rámečcích je udána dávka, počet zvířat a pohlaví (1 - pohlaví zvolené jako první, 2 - pohlaví zvolené jako druhé).

Pod rámečky je počet uhynulých nebo utracených zvířat (0, 1, 2, 3). Podle počtu uhynulých zvířat se v testování pokračuje ve směru šipek až do dosažení šedého rámečku.

Varianta 1 - Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku nebo podle způsobu vyhodnocení uvedeného v Dodatku 2.

Varianta 2 - Pokračování testu s příslušnou doplňkovou dávkou.

Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku.

V rámečcích je udána dávka, počet zvířat a pohlaví (1 - pohlaví zvolené jako první, 2 - pohlaví zvolené jako druhé).

Pod rámečky je počet uhynulých nebo utracených zvířat (0, 1, 2, 3). Podle počtu uhynulých zvířat se v testování pokračuje ve směru šipek až do dosažení šedého rámečku.

Varianta 1 - Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku nebo podle způsobu vyhodnocení uvedeného v Dodatku 2.

Varianta 2 - Pokračování testu s příslušnou doplňkovou dávkou.

Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku.

V rámečcích je udána dávka, počet zvířat a pohlaví (1 - pohlaví zvolené jako první, 2 - pohlaví zvolené jako druhé).

Pod rámečky je počet uhynulých nebo utracených zvířat (0, 1, 2, 3). Podle počtu uhynulých zvířat se v testování pokračuje ve směru šipek až do dosažení šedého rámečku.

Varianta 1 - Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku nebo podle způsobu vyhodnocení uvedeného v Dodatku 2.

Varianta 2 - Pokračování testu s příslušnou doplňkovou dávkou.

Ukončení testu: Klasifikace se provede na základě konečných hodnot uvedených v příslušném šedém rámečku.

Je užitečné před pokusem získat údaje o rozdělení velikostí částic, tenzi par, teplotě tání, teplotě varu, teplotě vzplanutí a výbušnosti (jsou-li stanovitelné) testované látky

Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce po určenou dobu v odstupňovaných koncentracích, a to jedné koncentraci v každé skupině. Potom se zvířata pozorují a zjišťují se účinky a případy uhynutí. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nemají podávat v takových koncentracích a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a stres následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do potřebného počtu experimentálních skupin. Pokud to nevyžaduje typ používaného expozičního zařízení, není třeba podrobit zvířata simulované expozici.

Pevné testované látky je třeba rozmělnit na částice příslušné velikosti. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky; v tom případě se zařadí také kontrolní skupina s vehikulem. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Používá se běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty (pro každé pohlaví zvlášť).

Pro každou dávkovou hladinu je třeba použít nejméně 10 hlodavců (5 samic a 5 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí.

Má být dostatečný počet úrovní dávek, nejméně tři, a mají být vhodně odstupňovány tak, aby byl u testovacích skupin viditelný rozsah toxických účinků a mortality. Získané údaje musí stačit na znázornění vztahu mezi dávkou a mortalitou a, pokud je to možné, musí umožnit stanovení LC₅₀ s přijatelnou spolehlivostí.

Nedojde-li po 4 hodinové expozici 5 samců a 5 samic plynu v koncentraci 20 mg.l^-1 nebo parám či aerosolu tekuté nebo pevné látky v koncentraci 5 mg.l^-1 (nebo - v případech, kdy tuto koncentraci není možné použít v důsledku fyzikálních nebo chemických vlastností sledované látky včetně rizika výbuchu - při expozici maximální dosažitelné koncentraci) během 14 dnů k žádné mortalitě vyvolané sledovanou látkou, považují se další pokusy za zbytečné.

Nejkratší doba expozice má být 4 hodiny.

Pro pokusy se zvířaty je třeba použít inhalační zařízení, které umožňuje dynamické proudění vzduchu s výměnou vzduchu nejméně 12krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby se co nejvíce omezovalo shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla maximální. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu by neměl v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5 % objemu boxu. Je také možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.

Doba pozorování by měla trvat nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit rigorózně. Může záviset na toxických reakcích, na rychlosti jejich vzniku a na trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Rozhodující je doba, kdy se objeví a opět odezní projevy otravy, stejně jako doba do uhynutí, zvláště tam, kde je patrna tendence ke zpožděné mortalitě.

Zvířata se bezprostředně před expozicí zváží. Exponují se po dobu 4 hodin od ustavení rovnováhy koncentrace studované látky. Nastavení rovnováhy by mělo být rychlé. Teplota během pokusu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být ideálně mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Udržování mírně negativního tlaku uvnitř komory (≤ 5 mm vodního sloupce) zabrání unikání testované látky do okolí. Během expozice se nepodává potrava ani voda.

Používají se vhodné systémy pro vytvoření a monitorování testovací atmosféry. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji. Konstrukce a provoz boxu má zajišťovat homogenní distribuci testované atmosféry v komoře.

Je třeba zajistit měření nebo monitorování podmínek expozice:

Během expozice i po jejím skončení se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky. Každé zvíře má svůj individuální protokol. Během pivního dne je třeba provádět pozorování často. Minimálně jednou každý pracovní den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další každodenní pozorování a odpovídající opatření mají sloužit maximálnímu snížení ztrát zvířat pro studii, např. pitvou nebo zmrazením uhynulých zvířat nebo izolací či utracením slabých nebo umírajících zvířat.

Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vnějšímu dýchání, tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu. Okamžik uhynutí je třeba zachytit co nejpřesněji. Hmotnost jednotlivých zvířat se stanovuje po expozici týdně a v okamžiku uhynutí.

Zvířata, která během pokusu uhynou i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají se zvláštním zřetelem ke všem změnám horní i dolní části dýchacího traktu. Všechny makroskopické patologické změny se zaznamenávají a odeberou se příslušné tkáně pro histopatologické vyšetření.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu, doba uhynutí jednotlivých zvířat, počet zvířat vykazujících další příznaky toxicity, popis toxických účinků a pitevní nálezy. Změny hmotnosti je třeba vypočítat a zaznamenat pokud zvířata přežijí déle než jeden den. Zvířata, která jsou humánně utracena vzhledem ke stresu nebo k bolestem vyvolaným testovanou látkou, jsou zaznamenána jako uhynutí vyvolaná testovanou látkou. LC₅₀ se vypočte uznávanou metodou. Dále se hodnotí vztah – pokud existuje – mezi expozicí zvířete testované látce a výskytem a stupněm všech abnormalit, včetně změn chování, klinických symptomů, makroskopických poškození, změn tělesné hmotnosti, mortality a všech dalších toxických účinků.

Zpráva o průběhu pokusu obsahuje pokud možno následující informace:

Pozn.: při expozici aerosolům látek v roztoku (např. ve vodě) je třeba uvádět nejen výslednou koncentraci látky ve vzduchu, nýbrž také, pokud je to možné, koncentraci účinné látky ve vehikulu.

Testovaná látka se nanáší na kůži v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Pozorují a zaznamenávají se účinky a případy uhynutí. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba humánním způsobem utratit. Testované látky se nemají podávat v takových dávkách a takovým způsobem, o kterých je známo, že vyvolávají značnou bolest a stres následkem svých leptavých nebo dráždivých vlastností.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v pokusných klecích v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Asi 24 hodin před zahájením testu se srst zvířat na zádech ostříhá nebo oholí. Při stříhání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila (např.abrazí) kůže, což by mohlo změnit její propustnost. Pro aplikaci testované látky se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Při pokusech s pevnými látkami, případně připravenými v práškové formě, je třeba látku dostatečně navlhčit vodou nebo vhodným vehikulem, aby byl dobrý kontakt s kůží. Při použití vehikula je nutné brát v úvahu vliv vehikula na průnik testované látky kůží. Výběr vehikula by se měl řídit tím, v jaké formě se může daná látka ostat do styku s lidskou kůží, a ze všech relevantních způsobů vybrat ten, který nejvíce usnadňuje průnik kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné.

Pužívá se dospělých potkanů nebo králíků. Lze použít i jiné živočišné druhy, pokud jsou pro to důvody. Je třeba volit známé kmeny pokusných zvířat. Na začátku testu by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.

Pro každou úroveň dávek použít nejméně 5 zvířat stejného pohlaví. Používá-li se samic, musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud je k dispozici informace, že jedno z obou pohlaví je výrazně citlivější, je třeba používat zvířata tohoto pohlaví.

Má být dostatečný počet dávkových úrovní, nejméně tři, a mají být vhodně odstupňovány tak, aby vznikly testovací skupiny se zřetelným rozsahem toxických účinků a mortality. Při rozhodování o úrovních dávek je třeba vzít v úvahu dráždivé nebo leptavé účinky testované látky. Získané údaje musí stačit na znázornění vztahu mezi dávkou a účinkem, a pokud možno umožnit stanovení LD₅₀ s přijatelnou spolehlivostí.

Lze provést limitní test jednou dávkou nejméně 2000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti na skupinách 5 samců a 5 samic s použitím výše popsaných postupů. Pokud látka způsobí uhynutí, je třeba provést úplnou studii.

Doba pozorování má být nejméně 14 dní. Nelze ji však stanovit rigorózně. Měla by být určena podle obrazu otravy, rychlosti vývoje otravy a trvání fáze zotavení. Dobu pozorování je možno podle potřeby prodloužit. Rozhodující je doba, kdy se příznak otravy projeví a vymizí a doba do uhynutí, zvláště tam, kde je patrná tendence k výskytu pozdních uhynutí.

Zvířata se chovají jednotlivě v klecích. Testovaná látka se nanese rovnoměrně na plochu, která činí asi 10 % celkového povrchu těla. Pro vysoce toxické látky může být tato plocha menší; mělo by se však aplikovat stejnoměrně na co největší část této plochy.

Testovaná látka je po expoziční dobu 24 hodin udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovanou plochu je dále třeba vhodným způsobem překryt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou immobilizaci však nelze doporučit.

Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo jiným vhodným způsobem se provede očištění pokožky.

Pozorování je třeba ihned systematicky zaznamenávat. Pro každé zvíře je třeba vést samostatné záznamy. První den se zvířata pozorují často. Nejméně jednou každý pracovní den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další každodenní pozorování a odpovídající opatření mají sloužit maximálnímu snížení ztrát zvířat pro studii, např. pitvou nebo zmrazením uhynulých zvířat nebo izolací a utracením slabých či umírajících zvířat.

Pozorování zahrnuje změny srsti, kůže, na kterou byla provedena aplikace, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Zvláštní pozornost je třeba věnovat tremoru, křečovým jevům, slinění, průjmu, letargii, spánku a komatu.

Okamžik uhynutí je třeba zachytit co nejpřesněji. Zvířata, která během pokusu uhynou, i která přežijí až do konce pokusu, se pitvají. Všechny makroskopické patologické změny se zaznamenávají a poškozené tkáně se odeberou pro histopatologické vyšetření.

Po dokončení studie na jednom pohlaví se podá látka nejméně jedné skupině o pěti zvířatech druhého pohlaví, aby se zjistilo, zda zvířata druhého pohlaví nejsou výrazně citlivější na testovanou látku. V konkrétních případech může být odůvodněno použití menšího počtu zvířat. Pokud je k dispozici spolehlivá informace, že zvířata testovaného pohlaví jsou výrazně citlivější, testování na zvířatech druhého pohlaví je možno vynechat.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu, doba uhynutí jednotlivých zvířat, počet zvířat s jinými projevy otravy, popis toxických účinků a pitevních nálezů. Stanovení hmotnosti jednotlivých zvířat se provede bezprostředně před podáním testované látky, pak v týdenních intervalech a před utracením. Změny hmotnosti je třeba stanovit a zaznamenat, přežijí-li zvířata déle než jeden den. Zvířata, která byla humánním způsobem utracena s ohledem na stres a bolesti vyvolané podanou látkou, se zaznamenávají jako uhynutí vyvolané touto látkou. LC₅₀ se vypočte uznávanou metodou. Dále se hodnotí vztah, pokud existuje, mezi expozicí zvířat testované látce a výskytem a stupněm všech abnormalit včetně změn chování, klinických symptomů, makroskopických lézí, změn tělesné hmotnosti, mortality a všech ostatních toxických účinků.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

Výchozí úvahy

Je třeba pečlivě zvážit všechny dostupné informace o dané látce s cílem snížit na minimum testování látky za podmínek, které mohou vyvolat výrazné těžké reakce. Následující informace může být užitečná pro posouzení, zda je vhodný úplný test, studie na jediném zvířeti nebo zda není zapotřebí další testování.

Studovaná látka se nanese v jednorázové dávce na kůži několika pokusných zvířat, přičemž každé zvíře slouží jako svoje vlastní kontrola. Po stanovené době se odečte, vyhodnotí a následně popíše stupeň podráždění, aby bylo možno provést úplné posouzení účinků. Doba pozorování musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možné plně zhodnotit také reverzibilitu pozorovaných účinků.

Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba humánním způsobem utratit.

Asi 24 hodin před zahájením testu se srst zvířat na zádech ostříhá nebo oholí. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Je možno použít pouze zvířata se zdravou, neporaněnou kůží.

Některé kmeny králíka mají ostrůvky husté srsti, které jsou výraznější v některých obdobích roku. Testované látky se nesmí nanášet na tyto zóny růstu husté srsti.

Při pokusech s pevnými látkami, případně připravenými v práškové formě, je třeba testovanou látku dostatečně navlhčit vodou, případně jiným vhodným vehikulem, aby byl dobrý kontakt s kůží. Při použití vehikula je nutné brát v úvahu vliv vehikula na podráždění kůže testovanou látkou. Testované kapaliny se zpravidla aplikují nezředěné.

Je možné použít různé druhy savců, je však třeba dát přednost albínu králíka.

Jestliže je z in vitro screeningových testů nebo jiných úvah podezření, že látka může vyvolávat nekrózu (např.je leptavá) je třeba uvážit provedení testu na jednom zvířeti. Jestliže výsledky tohoto testu nenaznačují leptavé účinky, je třeba doplnit testování na dvou dalších zvířatech.

Pro úplný test jsou nutná nejméně tři zdravá dospělá zvířata. Není třeba zvláštních zvířat pro neošetřenou kontrolní skupinu, pro vyjasnění případů nejednoznačných reakcí mohou být použita další zvířata.

Pokud nejsou žádné zvláštní důvody pro jiný postup, nanese se na testovací místo kůže 0,5 ml kapaliny nebo 0,5 g tuhé nebo polotuhé látky. Přilehlé oblasti neošetřené kůže zvířete slouží v testu jako vlastní kontrola.

Dobu pozorování není možno stanovit rigorózně. Musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možno úplně vyhodnotit vratnost nebo nevratnost účinků. Normálně není třeba překračovat dobu 14 dnů po aplikaci.

Zvířata se chovají jednotlivě v klecích. Testovaná látka se nanese na malou plochu (asi 6 cm²) kůže a pokryje se plátkem mulu přidržovaným nedráždivou náplastí. U kapalin a některých past může být vhodné nanést nejprve testovanou látku na mul, a pak jej připevnit na kůži. Po dobu trvání expozice je třeba přidržovat plátek volně na kůži vhodným okluzivním nebo částečně okluzivním obvazem. Je třeba zabránit tomu, aby se zvíře dostalo k mulu a mohlo přijmout testovanou látku orálně nebo ji vdechnout.

Na konci doby exposice je třeba odstranit zbylou testovanou látku vodou, pokud je to možné, nebo vhodným rozpouštědlem, ale tak, aby nebyla ovlivněna případná reakce kůže nebo celistvost pokožky.

Doba expozice je obvykle 4 hodiny.

Pokud existuje podezření, že látka může vyvolat nekrózu (např.tím, že působí poleptání, je třeba zkrátit délku expozice (např. na 1 hodinu nebo 3 minuty). Při takovém testování je možné použít nejprve jediné zvíře a aplikovat 3 plátky mulu současně, pokud to akutní dermální toxicita testované látky nevylučuje. První plátek se odstraní po 3 minutách. Pokud není pozorována závažná kožní reakce, odstraní se druhý plátek po 1 hodině. Pokud pozorování v této fázi naznačují, že je nezbytná 4-hodinová expozice a že neodporuje principu humánního zacházení, odstraní se třetí plátek po 4 hodinách a klasifikují se stupně odpovědi kůže. V případě, že byla možná 4 hodinová expozice, je třeba doplnit test s použitím nejméně dvou dalších zvířat; pokud to není kontraindikováno z humánních důvodů (např. jestliže po 4 hodinách expozice je pozorována nekróza kůže).

Jestliže je závažná kožní reakce (např. nekróza) pozorována po 3 minutách nebo po 1 hodině, je test okamžitě ukončen.

Za určitých podmínek je možné navrhnout delší expozice, například pokud to odpovídá očekávanému způsobu použití a expozici u člověka

Zvířata je třeba pozorovat na příznaky erytému a kožního edému a stupeň reakce kůže po 60 minutách a dále 24, 48 a 72 hodin po odstranění plátku s testovanou látkou. Stupeň podráždění kůže se klasifikuje a zaznamenává podle systému uvedeného v tabulce 1. Jestliže nebylo během 72 hodin dosaženo úplného odeznění reakce, provádí se pozorování dále. Vedle podráždění kůže je třeba podrobně popsat všechny závažné léze jako poleptání (nevratná destrukce kožní tkáně) a jiné toxické účinky. K objasnění pochybných reakcí nebo odpovědí, maskovaných zabarvením kůže testovanou látkou, je třeba použít technik histopatologického vyšetření nebo měření tlouštky kožní řasy.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každé pokusné zvíře patrný stupeň podráždění posouzením erytému a edému po celou dobu pozorování. Je třeba rovněž uvést všechny závažné léze, popis stupně a povahy podráždění kůže, reversibilitu nebo poleptání a všechny další pozorované toxické účinky.

Zpráva o průběhu pokusu obsahuje pokud možno tyto informace:

I_KI se vypočte jako aritmetický průměr ze součtů stupně reakce pro erytém a edém v jednotlivých intervalech odečtu u jednoho jedince a z takto získaných hodnot u všech exponovaných jedinců se vypočte aritmetický průměr.

Je třeba pečlivé zvážit všechny dostupné informace o dané látce s cílem snížit na minimum testování látky za podmínek, které mohou vyvolat těžké reakce. K tomu mohou být užitečné následující informace.

Testovaná látka se v jednorázové dávce aplikuje do jednoho oka několika pokusným zvířatům, přitom neexponované oko slouží jako kontrola. Ve stanovených intervalech se odečte a vyhodnotí stupeň podráždění a reakce se dále popíše, aby bylo možno provést úplné posouzení účinku. Doba pozorování musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možné jednoznačně zhodnotit také vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků.

Zvířata se závažnými a přetrvávajícími příznaky stresu a bolesti je třeba humánním způsobem utratit.

24 hodin před testem se u každého z předběžně vybraných pokusných zvířat provede vyšetření obou očí. Zvířata, u kterých se zjistí podráždění očí, oční defekt nebo poškození rohovky se z experimentu vyloučí.

Ačkoliv se používají různé druhy pokusných zvířat, doporučuje se dávat přednost zdravému dospělému albinotickému králíku.

Jestliže se očekávají výrazné účinky, je třeba zvolit test na jediném zvířeti. Jestliže výsledky tohoto testu na jednom králíkovi naznačují, že látka má výrazně dráždivé (reversibilní účinek) nebo leptavé (irreversibilní účinek) účinky pro oko při použití popsaného postupu, není třeba další testování oční dráždivosti u dalších zvířat. K vyšetření specifických aspektů mohou být případně testována další zvířata.

V ostatních případech je třeba použít nejméně tří zvířat. Vyjasnění nejednoznačných nálezů může vyžadovat použití dalších zvířat.

Při testování kapalin se používá dávka 0,1 ml. U tuhých látek, past a trnitých látek je třeba použít objem 0,1 ml nebo hmotnost cca 0,1 g (hmotnost je vždy třeba uvést). Jedná-li se o tuhou nebo hrubě zrnitou látku, je třeba ji rozemlít na jemný prášek. Objem homogenní látky se stanoví až po opatrném zhutnění, např. poklepáváním na měrnou nádobku.

U látek uzavřených ve sprejích s pumpou nebo tlakových aerosolových nádobkách je třeba vystříknout a sebrat 0,1 ml látky a instilovat ji do oka podle popisu pro kapaliny.

Délku doby pozorování není možno stanovit rigorózně. Musí být dostatečně dlouhá, aby bylo možno posoudit vratnost nebo nevratnost pozorovaných účinků. Normálně však stačí 21 dnů po aplikaci studované látky.

Zvířata je třeba přechovávat jednotlivě v klecích. Testovaná látka se aplikuje každému zvířeti do spojivkového vaku jednoho oka tak, že se spodní víčko lehce odchlípne od oční bulvy. Víčka se pak asi na 1 sekundu lehce k sobě přidrží, aby se žádná látka neztratila. Druhé oko, na které se látka neaplikuje, slouží jako kontrolní.

Jestliže se předpokládá, že látka může vyvolat přílišnou bolest, lze před instilací testované látky použít lokální anestetikum. Aby bylo zajištěno, že následkem anestetika nedojde k významným změnám v reakci na testovanou látku, je třeba pečlivě zvolit typ, koncentraci a dobu aplikace lokálního anestetika. Stejným způsobem se musí anestezovat i kontrolní oko.

Oči pokusných zvířat je možno vymývat nejdříve 24 hodiny po aplikaci testované látky. Po 24 hodinách je možno oči vypláchnout, pokud se to považuje za vhodné.

U některých látek, které při této testovací metodě vyvolají podráždění, je možno provést další zkoušky s použitím králíků, kterým se brzy po instilaci látky vymyjí oči. V těchto případech se doporučuje použít 3 králíky. Půl minuty po instilaci se oči vymývají rovněž po půl minuty s použitím takového objemu kapaliny a rychlosti průtoku, aby nedošlo k poškození.

Oči se vyšetřují po 1, 24, 48 a 72 hodinách. Neprojevují-li se po 72 hodinách žádné příznaky očních lézí, je možno zkoušku ukončit. Dobu pozorování je třeba prodloužit, pokud přetrvává postižení rohovky nebo jiné příznaky podráždění oka tak, aby bylo možno posoudit vývoj změn a jejich vratnost či nevratnost. Vedle pozorování na rohovce, duhovce a spojivce je třeba zaznamenat a uvést ve zprávě i jiné zjištěné léze.

Intenzitu reakce oka je třeba při každém vyšetření stanovit podle stupnice v příloze a zaznamenat. (Klasifikace reakcí oka připouští různé možnosti interpretace. Jako pomůcku pro testující laboratoře a ty, kdo provádějí hodnocení, je možno použít ilustrovanou referenční tabulku podráždění oka.)

Vyšetřování reakcí je možno usnadnit použitím binokulární lupy, ruční štěrbinové lampy, očního mikroskopu nebo jiných vhodných zařízení. Po zaznamenání pozorování po 24 hodinách je možno oči některých nebo všech zvířat vyšetřit mimoto ještě fluoresceinem.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každé pokusné zvíře patrný stupeň podráždění v daném intervalu pozorování. Je třeba uvést popis stupně a charakteru podráždění, přítomnost závažných lézí a všechny mimooční účinky.

Zpráva o průběhu pokusu obsahuje následující informace:

Individuální index oční dráždivosti (I _OI) pro každé zvíře a každý interval hodnocení se vypočte podle vztahu

Průměrný index oční dráždivosti (I_OP) pro každý interval hodnocení se vypočte pro každý interval hodnocení jako průměr z I_OI.

Akutní index oční dráždivosti I_OA je roven nejvyššímu I_OP zjištěnému v průběhu testu

Citlivost a detekční schopnost testů pro zjišťování látek s potenciálním senzibilizačním účinkem na lidskou kůži jsou považovány za významné pro klasifikační systém toxicity v oblasti veřejného zdravotnictví.

Neexistuje jediná testovací metoda, která by dostatečně spolehlivě identifikovala všechny látky s potenciálním senzibilizačním účinkem pro lidskou kůži a která by se hodila pro všechny látky.

Při volbě testu je třeba uvažovat faktory jako např. fyzikální charakteristiky látky, včetně schopnosti průniku kůží.

Testy na morčatech lze rozdělit na testy s adjuvans, ve kterých je alergický stav potencován rozpuštěním nebo suspendováním testované látky ve Freundově kompletním adjuvans (FCA), a na testy bez adjuvans.

Testy s adjuvans se zdají být přesnější v predikci pravděpodobného senzibilizačního účinku pro lidskou kůži než metody bez Freundova kompletního adjuvans, a proto se jim dává přednost.

Maximizační test na morčatech(Guinea-pig Maximization Test - GPMT) je velmi rozšířený test s adjuvans. Ačkoliv k odhalení schopnosti látky vyvolat senzibilizační reakci existuje několik dalších metod, je GPMT považován za preferovanou techniku s adjuvans.

U mnoha skupin chemických látek jsou testy bez adjuvans (přednost se dává Buehlerovu testu) považovány za méně citlivé.

V určitých případech lze zdůvodnit volbu Buehlerova testu s povrchovou aplikací spíše než intradermální injekci používanou v maximizačním testu na morčatech. Pro použití Buehlerova testu je třeba uvést odborné důvody.

V této metodické kapitole jsou popsány maximizační test na morčeti (GPMT) a Buehlerův test. Lze použít i jiných metod, pokud jsou spolehlivě validizované a pokud jsou odborné důvody pro jejich použití.

Pokud screeningový test provedený uznávanou metodou dá pozitivní výsledek, je možno testovanou látku označit jako potenciální senzibilizátor bez dalšího testování na morčatech. Při negativním výsledku je však nutné provést test na morčeti, tak jak je popsán v této metodické kapitole.

Senzibilizace kůže: (alergická kontaktní dermatitida) je imunologicky zprostředkovaná kožní reakce na látku. U člověka mohou být reakce charakterizované svěděním, zarudnutím kůže, otokem, pupenci, puchýřky, bulami (velkými puchýři) nebo kombinací těchto příznaků. U jiných živočišných druhů se mohou reakce lišit a může být zjištěno pouze zarudnutí nebo otok.

Indukční expozice: experimentální expozice subjektu testované látce se záměrem navodit stav přecitlivělosti.

Indukční období: období nejméně jednoho týdne po indukční expozici, v průběhu kterého se může rozvinout stav přecitlivělosti.

Provokační expozice (challenge): experimentální expozice subjektu dříve vystaveného testované látce po indukčním období pro stanovení, zda subjekt odpoví reakcí přecitlivělosti.

Citlivost a spolehlivost použité experimentální metody by měla být ověřována každých šest měsíců s použitím látek, o kterých je známo, že mají mírný až středně silný senzibilizační účinek pro kůži.

U správně provedeného testu se očekává reakce na mírné/střední senzibilátory nejméně 30 % u metody s adjuvans, a nejméně 15 % u metody bez adjuvans.

Přednost se dává následujícím látkám:

Mohou nastat okolnosti, kdy při dostatečném odborném zdůvodnění mohou být použity jiné kontrolní látky splňující výše uvedená kritéria.

Pokusná zvířata jsou nejprve exponována testované látce intradermálními injekcemi případně epidermální aplikací (indukční expozice). Po období 10 až 14 dnů (indukční období), v průběhu kterého se může rozvinout imunitní reakce, jsou zvířata exponována provokační dávce. Rozsah a stupeň kožní reakce na provokační expozici u testovaných zvířat je porovnáván s rozsahem a stupněm reakce u kontrolních zvířat, která podstoupí klamnou expozici v době indukce a je jim aplikována provokační dávka.

Jestliže je považováno za nezbytné odstranit testovanou látku, provede se to s použitím vody nebo vhodného rozpouštědla tak, aby nebyla narušena vzniklá kožní reakce nebo integrita pokožky.

Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky po dobu aspoň 5 dnů před zahájením testu. Před testem se zvířata náhodně rozdělí do expozičních a kontrolních skupin. Odstranění srsti se provede stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité testovací metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením testu a na konci testu.

Používají se běžné laboratorní kmeny albinotických morčat.

Lze použít samce i samice. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Exponovanou skupinu tvoří nejméně 10 zvířat a nejméně 5 zvířat je třeba v kontrolní skupině. Použije-li se menšího počtu než 20 testovaných a 10 kontrolních morčat a není možné dojít k závěru, že testovaná látka je senzibilizátor, doporučuje se testování na dalších zvířatech, aby se dosáhlo celkového počtu nejméně 20 testovaných a 10 kontrolních zvířat.

Koncentrace testované látky použitá pro každou indukční expozici se upraví na takovou úroveň, kterou zvířata celkově dobře snášejí a která je nejvyšší působící mírné až střední podráždění kůže. Jako provokační koncentrace se použije maximální koncentrace, která u nesenzibilizovaných zvířat nevyvolává podráždění kůže. V případě potřeby je možno vhodné koncentrace stanovit v předběžném pokusu na dvou nebo třech zvířatech. Pro tento účel lze uvážit použití zvířat, kterým bylo aplikováno FCA.

Den 0 - Testovaná skupina

Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do lopatkové oblasti zbavené srsti symetricky podle střední linie:

Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1:1;

Injekce 2: testovaná látka ve vhodném vehikulu ve zvolené koncentraci;

Injekce 3: testovaná látka ve zvolené koncentraci připravená ve směsi FCA s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1 : 1.

Pro injekci 3 se látky ve vodě rozpustné rozpustí před smísením s FCA ve vodné fázi. Látky rozpustné v lipidech nebo látky nerozpustné se rozptýlí v nezředěném FCA. Konečná koncentrace testované látky pro injekci 3 má být stejná jako pro injekci 2.

Injekce 1 a 2 se aplikují blízko sebe a co nejblíže hlavě, zatímco injekce 3 směrem ke kaudální části testovací plochy.

Den 0 - Kontrolní skupina

Následující 3 dvojice subkutánních injekcí, každá po 0,1 ml, se podají do stejných míst jako u testovaných zvířat:

Injekce 1: Freundovo kompletní adjuvans (FCA) smíšené s vodou nebo fyziologickým roztokem v objemovém poměru 1:1;

Injekce 2: neředěné vehikulum;

Injekce 3: Směs vehikula (50 %, váha / objem) se směsí FCA/vody nebo fyziologického roztoku v poměru 1 : 1 (objem / objem).

5. - 7. den - Testované a kontrolní skupiny

Přibližně dvacet čtyři hodin před lokální indukční aplikací, jestliže látka není dráždivá pro kůži, se na testovací plochu po důkladném ostříhání případně oholení natře 0,5 ml 10 % laurylsulfátu sodného ve vazelíně, za účelem navození místního podráždění.

6. - 8. den - Testovaná skupina

Testovací plocha se zbaví srsti. Testovanou látkou ve vhodném vehikulu je napuštěn filtrační papír (2 x 4 cm), který se pak přiloží na testovací plochu a fixuje pomocí okluzivního obvazu na dobu 48 hodin. Výběr vehikula se řídí odbornými důvody; pevné látky jsou jemně rozetřeny a převedeny do vhodného vehikula; kapaliny lze aplikovat přímo.

6. - 8. den - Kontrolní skupina

Testovací plocha se znovu zbaví srsti. Samotné vehikulum se nanese a zafixuje podobně jako u exponované skupiny na dobu 48 hodin.

20. - 22. den - Testované a kontrolní skupiny

Boky exponovaných i kontrolních zvířat jsou zbaveny srsti. Na jeden bok zvířete je aplikována testovaná látka v plátku nebo v komůrce a na druhý bok se stejným způsobem aplikuje pouze vehikulum (pokud je to třeba). Plátky se pomocí okluzivního obvazu udržují v kontaktu s kůží po 24 hodiny.

Doporučuje se systém “slepého odečtu“ u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.

Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině. Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona / Kligmana (viz dodatek). K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožních řas.

Zdravá mladá dospělá albinotická morčata se aklimatizují na laboratorní podmínky po dobu aspoň 5 dnů před zahájením testu. Před testem se zvířata náhodně rozdělí do expozičních a kontrolních skupin. Odstranění srsti se provede stříháním, holením nebo chemickou depilací, v závislosti na použité testovací metodě. Je třeba dbát na to, aby nedošlo k poškození kůže. Zvířata se zváží před zahájením testu a na konci testu.

Používají se běžné laboratorní kmeny albinotických morčat.

Lze použít samce a/nebo samice. Samice musí být nullipary a nesmí být březí.

Použije se minimálně 20 zvířat v testované skupině a nejméně 10 zvířat v kontrolní skupině.

Koncentrace testované látky použitá pro každou indukční expozici se upraví na takovou úroveň, která je nejvyšší působící mírné ale ne velmi silné podráždění kůže. Jako provokační koncentrace se použije maximální koncentrace, která u nesenzibilizovaných zvířat nevyvolává podráždění kůže. V případě potřeby je možno vhodné koncentrace stanovit v předběžném pokusu na dvou nebo třech zvířatech.

Pro testované látky rozpustné ve vodě je vhodné použít vodu nebo zředěný nedráždící roztok detergentu jako vehikula. Pro jiné látky je preferován 80 % roztok etanol / voda pro indukci a aceton pro provokaci.

Den 0 - Testovaná skupina

Jeden bok je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Systém plátkového testu se dokonale nasytí testovanou látkou ve vhodném vehikulu (výběr vehikula se řídí odbornými důvody; kapaliny lze případně aplikovat přímo).

Plátkový test je přiložen na testovací plochu a přidržován v kontaktu s kůží překrývacím plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem po dobu 6 hodin.

Systém plátkového testu musí být okluzivní. Vhodný je bavlněný polštářek, ať už kruhový nebo čtverhranný, s plochou přibližně 4 - 6 cm². Je preferováno přidržení s použitím vhodného přidržovače, aby se zajistila okluze. Jestliže je použito obvázání, mohou být nutné další expozice.

Den 0 – Kontrolní skupina

Jeden bok je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Na testovací plochu je naneseno pouze vehikulum, a to podobným způsobem jako u testované skupiny. Plátkový test je přiložen na testovací plochu a přidržován v kontaktu s kůží překrývacím plátkem nebo komůrkou a vhodným obvazem po dobu 6 hodin. Pokud je možno prokázat, že negativní kontrolní skupina není nutná, lze použít čisté kontrolní skupiny bez aplikace.

6. - 8. a 13. - 15. den -Testovaná a kontrolní skupina

Stejná aplikace jako v den 0 se provede na stejnou testovací plochu na tomtéž boku (zbavenou případně srsti) 6.-8. den a znovu 13.-15. den.

27. - 29. den - Testovaná a kontrolní skupina

Neošetřený bok testovaných a kontrolních zvířat je zbaven srsti (důkladně ostříhán). Okluzivní plátek obsahující příslušné množství testované látky v maximální nedráždivé koncentraci se aplikuje na zadní část neošetřeného bok testovaných a kontrolních zvířat. Na přední část neošetřeného boku testovaných a kontrolních zvířat se případně může aplikovat okluzní plátek s vehikulem. Překrývací plátky nebo komůrky jsou přidržovány v kontaktu s kůží vhodným obvazem po dobu 6 hodin.

Doporučuje se systém “slepého odečtu“ u testovaných i kontrolních zvířat, kdy pozorující osoba neví, které zvíře bylo senzibilizováno a které je kontrolní.

Pokud je k vyjasnění výsledků nutná druhá provokace (tj. opakovaná provokace), provede se přibližně o týden později, v případě potřeby znovu s kontrolní skupinou s vehikulem. Opakovanou provokaci lze také provést na původní kontrolní skupině.

Všechny kožní reakce a neobvyklé nálezy, včetně celkových reakcí, které jsou důsledkem indukčních a provokačních postupů se zaznamenávají podle stupnice Magnussona/Kligmana (viz dodatek). K objasnění sporných nálezů je možno použít dalších technik, jako např. histopatologického vyšetření nebo měření tloušťky kožních řas.

Údaje se sestaví do tabulky, ze které musí být pro každé pokusné zvíře patrná reakce kůže při každém pozorování.

Pokud byl proveden před zahájením testu na morčatech test screeningový, je třeba uvést popis tohoto testu nebo jeho citaci (např. LLNA - test regionálních lymfatických uzlin, MEST - test ztluštění ucha u myší) včetně všech podrobností postupu a výsledků získaných pro testované a referenční látky.

Zpráva o pokusu obsahuje tyto informace, pokud mohly být získány:

Tato metoda je analogická s metodou OECD TG 406.

Podle frekvence pozitivity při provokační expozici, tj. podle toho kolik zvířat v rámci pokusu bylo danou látkou senzibilizováno, se látka klasifikuje jako

Testovaná látka se podává denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat orálně, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pečlivě pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Pitva se provede u všech zvířat, která uhynou nebo jsou utracena během pokusu; také zvířata, která přežijí konec pokusu, se utratí a pitvají.

Zdravá mladá zvířata se náhodně přiřadí do kontrolní skupiny a jednotlivých experimentálních skupin. Klece jsou uspořádány tak, aby se co nejvíce vyloučil vliv umístění klece. Každé jednotlivé zvíře je jednoznačně označeno. Nejméně 5 dní před začátkem studie jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu.

Testovanou látku lze podávat sondou nebo v potravě nebo v pitné vodě, podle účelu studie a fyzikálně-chemických vlastností látky.

Pokud je to třeba, rozpustí nebo suspenduje se testovaná látka ve vhodném nosiči (vehikulu). Doporučuje se nejprve zvážit použití vodného roztoku / suspenze, pak použití roztoku / emulze v jedlém rostlinném oleji (např. kukuřičném) a pak roztoku v jiných nosičích. Pro nevodná vehikula musí být známa jejich toxická charakteristika; pokud není známa, musí být stanovena ještě před testem. Je nezbytné ověřit stabilitu látky v zvoleném vehikulu.

Dává se přednost potkanům, ale je možno použít i jiného druhu hlodavců. Je třeba používat mladých zdravých zvířat z běžně užívaných pokusných kmenů. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Podávání látky by mělo začít co nejdříve po odstavu a v každém případě dříve než zvířata dosáhnou věku 9 týdnů.

Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20 % střední hodnoty.

Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít zvířata stejného kmene a ze stejného zdroje.

Pro každou hladinu dávek se použije nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu.

Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po podávání sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).

Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.

Pokud se podle dostupných informací nedá očekávat účinek při denní dávce 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti, je možno provést limitní test. Nejsou-li taková data k dispozici, lze provést předběžnou vyhledávací studii za účelem stanovení dávek.

Při výběru dávek je třeba vzít v úvahu všechny existující údaje z toxikologických a toxikokinetických studií o testované látce případně látkách příbuzných.

Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí ani velké utrpení. Dále se vyberou dávky v klesající řadě tak, aby umožnily prokázat závislost účinku na dávce. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity (NOAEL). Obvykle je vhodný dvoj- až čtyřnásobný odstup mezi sousedními dávkami; pokud je potřeba pokrýt větší rozsah dávek, je lepší přidat čtvrtou dávkovou skupinu, než zvolit příliš velký odstup mezi dávkami (např. faktor větší než 10).

Pokud se testovaná látka podává v potravě nebo pitné vodě, je důležité zajistit, aby podávané množství látky neovlivňovalo výživu a vodní rovnováhu. Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Aplikuje-li se látka sondou, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.

Pokud má tato studie sloužit jako předběžný pokus před dlouhodobou studií, je třeba v obou studiích použít stejné potravy.

Neprokáže-li test provedený zde popisovaným způsobem žádné toxické účinky při dávce 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti za den nebo při takové koncentraci v potravě nebo vodě, která této dávce odpovídá, a pokud toxicita testované látky nevyplývá z analogie s příbuznými látkami, je možno od provedení kompletního testování při třech dávkových úrovních upustit. Toto pravidlo limitního testu platí, pokud údaje o expozici lidí nenaznačují, že je třeba testovat při vyšších dávkách.

Doba pozorování je 28 dní. Zvířata satelitní skupiny jsou pozorována nejméně dalších 14 dnů bez aplikace s cílem zachytit případné zpožděné účinky a pro posouzení přetrvávání nebo vratnosti účinku.

Zvířatům se podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 28 dnů, ve zdůvodněných případech 5 dní v týdnu. Denní dávka se podává jednorázově žaludeční sondou nebo vhodnou intubační kanylou. Maximální objem tekutiny, který může být podán najednou, závisí na velikosti zvířete. Objem by neměl normálně přesáhnout 1 ml na 100 g tělesné hmotnosti, v případě vodných roztoků lze podat i 2 ml na 100 g tělesné hmotnosti. Rozdíly v podávaném objemu je třeba minimalizovat upravením koncentrace tak, aby byl podáván týž objem na všech úrovních dávky. Neplatí to u látek dráždivých a leptavých, u kterých je třeba obvykle počítat se stupňovanými účinky při vyšších koncentracích.

Všeobecné klinické pozorování se provádí nejméně jednou denně, nejlépe v tutéž denní dobu a s uvážením doby očekávaného maxima účinku po aplikaci. Zaznamenává se zdravotní stav zvířat. Nejméně dvakrát denně se provede zběžná prohlídka všech zvířat za účelem zjištění morbidity a mortality. Zvířata moribundní a zvířata projevující silnou bolest nebo stres jsou vyřazena, utracena humánním způsobem a pitvána.

Důkladné klinické vyšetření všech zvířat se provede před první aplikací (za účelem intraindividuálního porovnání) a dále nejméně jednou týdně. Toto pozorování se děje mimo chovnou klec v standardním pozorovacím prostoru a nejlépe pokaždé ve stejnou denní dobu. Výsledky pozorování se pečlivě zaznamenávají, nejlépe s použitím skórovacího systému, standardizovaného v testující laboratoři. Je třeba zajistit, aby se podmínky pozorování měnily co nejméně; osoba, provádějící pozorování by nejlépe neměla znát příslušnost zvířat do dávkových skupin.

Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí a sliznic, přítomnost sekretů a exkretů, změny dýchání a vegetativních funkcí (slzení, zježení srsti, velikost zornic) a případně další. Zaznamenávají se změny chůze, polohy, dále reakce na manipulaci, přítomnost klonických a tonických pohybů, stereotypů v chování (vytrvalé čisticí pohyby nebo kroužení) nebo bizarních vzorců chování (např. sebepoškozování, pohyb pozadu).

Ve čtvrtém týdnu aplikace se otestují reakce na různé senzorické podněty (např. sluchové, zrakové, proprioceptivní), změří se síla úchopu a celková motorická aktivita. Další podrobné informace o postupech, které je možno k testování použít, jsou uvedeny v literatuře (viz Všeobecný úvod, část B).

Pozorování funkčních poruch ve čtvrtém týdnu aplikace lze případně vynechat, pokud 28-denní studie slouží jako předběžná studie pro následující studii subchronickou (90-denní); v tom případě je pozorování funkčních poruch zařazeno do této dlouhodobé studie. Ovšem i v tomto případě jsou údaje o funkčních poruchách ve čtvrtém týdnu 28-denní studie vhodným východiskem pro výběr dávek pro subchronickou studii.

Výjimečně lze vynechat pozorování funkčních poruch u skupin vykazujících takové příznaky toxicity, které by při posuzování funkčního stavu zvířete vadily.

Zvířata se váží nejméně jednou týdně. Spotřeba potravy a vody se měří nejméně jednou týdně, také v případě aplikace v pitné vodě.

Hematologické vyšetření na konci pokusu zahrnuje stanovení hematokritu, koncentrace hemoglobinu, počtu erytrocytů, celkového a diferenciálního počtu leukocytů, počtu trombocytů a změření srážlivosti krve.

Krev se odebere těsně před nebo v průběhu utracení zvířete, místo odkud se krev odebrala se zaznamená. Krev se skladuje za vhodných podmínek.

Biochemická analýz krve za účelem posouzení závažných toxických účinků na tkáně, zvláště na játra a ledviny, se provede u všech zvířat těsně před nebo v průběhu utracení (kromě zvířat uhynulých nebo utracených během pokusu). Doporučuje se nechat zvířata bez potravy přes noc před odběrem krve⁽¹¹⁾. Vyšetření plazmy a sera zahrnuje stanovení sodíku, draslíku, glukózy, celkového cholesterolu, močoviny, kreatininu, celkových proteinů, albuminu, aktivity alespoň dvou enzymů indikujících účinky na jaterní buňky ( jako alaninaminotransferáza, aspartátaminotransferáza, alkalická fosfatáza, gama glutamyltranspeptidáza, sorbitoldehydrogenáza). Změření dalších enzymů (jaterního nebo jiného původu) a žlučových kyselin může v některých případech poskytnout užitečné informace.

Další možnost je časově definovaný sběr a vyšetření moči během posledního týdne studie: hodnotit je možno vzhled, objem, osmolalitu nebo specifickou hmotnost, pH, bílkoviny, glukózu a krev příp. krvinky.

Dále je třeba uvážit stanovení nespecifických indikátorů poškození tkání v séru.

Další charakteristiky je třeba stanovit u látek známých nebo podezřelých z působení na určité metabolické funkce: stanovení vápníku, fosforu, triglyceridů na lačno, lipidů, specifických hormonů, methemoglobinu, aktivity cholinesterázy. Účelnost těchto vyšetření se posuzuje podle příslušnosti do určitých skupin látek nebo případ od případu.

Obecně je třeba postupovat pružně, brát v úvahu použitý živočišný druh a pozorované nebo očekávané účinky dané látky.

Pokud nejsou k dispozici údaje o normálních hodnotách některých hematologických nebo biochemických proměnných, je třeba uvážit jejich stanovení ještě před začátkem studie.

U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva, zahrnující pečlivé vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů, dutiny lební, hrudní a břišní, a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledvinky, varlata, nadvarlata, brzlík, slezina, mozek a srdce všech zvířat se řádně očistí od ulpěných tkání a co nejdříve po sekci se zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

Následující tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na typ tkáně a plánovaná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickými změnami, mozek (reprezentativní oblasti včetně hemisfér, mozečku a mostu), míchu, žaludek, tenké i tlusté střevo (včetně Peyerových plátů), játra, ledviny, nadledvinky, slezinu, srdce, brzlík, štítnou žlázu, průdušnici a plíce (konzervované naplněním fixačním roztokem a pak ponořením), gonády a přídatné pohlavní orgány (např. dělohu, prostatu), močový měchýř, lymfatické uzliny (přednostně jedna pro oblast aplikace a jedna vzdálená pro pokrytí systémových účinků), periferní nerv (n. ischiadicus nebo n. tibialis), nejlépe v blízkosti svalu, řez kostní dřeně (nebo čerstvý nátěr z nasáté kostní dřeně). Podle klinických nebo jiných nálezů je možno zvolit i další tkáně. Každý orgán, který by mohl být cílovým orgánem pro působení testované látky, je třeba uchovat.

U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami.

Všechny makroskopické léze je třeba vyšetřit.

U zvířat satelitních skupin, pokud byly do studie zařazeny, je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

K dispozici musí být údaje o každém jednotlivém zvířeti. Navíc jsou veškeré údaje sumarizovány do tabulkové formy, uvádějící u každé testované skupiny počet použitých zvířat, počet zvířat vykazujících příznaky toxicity, počet zvířat uhynulých v průběhu testu nebo utracených z humánních důvodů, dobu úmrtí jednotlivých zvířat, popis toxických příznaků včetně doby nástupu, trvání a závažnosti každého příznaku, počet zvířat vykazujících léze, typ lézí a procento zvířat s jednotlivými typy lézí.

Výsledky v číselné formě je třeba vyhodnotit vhodnou a uznávanou statistickou metodou. Statistickou metodu je třeba zvolit již při plánování studie.

Tato metoda je analogická metodě OECD TG 407.

Před pokusem je třeba získat údaje o testované látce: rozdělení velikosti částic, tenze par, bod tání, bod varu, bod vzplanutí a výbušnost (jsou-li stanovitelné).

Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 28 dní. Použije-li se pro dosažení vhodné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Pracuje se na mladých zdravých zvířatech z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty (pro každé pohlaví zvlášť).

Pro každou testovanou skupinu je třeba použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat vysoké koncentraci satelitní skupinu 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů a během následujících 14 dnů sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).

Použijí se nejméně tři skupiny s různou úrovní koncentrace a jedna kontrolní skupina, případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se užije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší koncentrace by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupinách s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

Trvání expozice má být 6 hodin denně; v případě specifických požadavků je možné použit i jiných dob expozice.

Pro pokusy se zvířaty se používá dynamické expoziční zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby se zamezilo co nejvíce shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry v inhalačním boxu neměl by v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5% objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.

Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozice i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 28 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 14 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Udržování mírně negativního tlaku uvnitř komory (≤ 5 mm vodního sloupce) zabrání unikání testované látky do okolí. Během expozice se nepodává potrava ani voda.

Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací.

Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.

Měření nebo monitorování podmínek expozice:

Během expozice a po jejím skončení se pozorování provádějí a zaznamenávají systematicky; každé zvíře má svůj individuální protokol. Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky toxických účinků a zaznamenávat jejich výskyt, stupeň a trvání. Pozorování zahrnuje změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení.

Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:

Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení, patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy na lačno, lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy.

Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.

U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně (dýchací systém, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny a srdce, i všechny orgány s makroskopickými změnami nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření. Plíce je třeba vyjmout bez poškození, zvážit a fixovat vhodným mediem, tak aby se zachovala struktura.

U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší koncentrace, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší koncentrací objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s jednotlivými formami poškození.

Všechny zjištěné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto k informace:

Testovaná látka se nanáší na kůži denně po 28 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí konec pokusu, se pitvají.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10% povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu. Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba danou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.

Je možno používat dospělé potkany, králíky nebo morčata. Je možno použít i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20% střední hodnoty.

Pro každou hladinu dávek použít nejméně 10 zvířat (5 samic a 5 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 10ti zvířat (5 zvířat každého pohlaví) po dobu 28 dnů nejvyšší dávku a během následujících 14 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků. Používá se také satelitní skupiny 10 kontrolních zvířat (5 zvířat každého pohlaví).

Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které se aplikuje skupině s nejvyšší dávkou. Nejvyšší dávka má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší dávka by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední dávka měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední dávkou a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové úrovně může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.

Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.

Všechna zvířata je třeba denně pozorovat na příznaky otravy. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a dobu, kdy se objeví a případně opět odezní příznaky otravy.

Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 28 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 14 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.

Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla; u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.

Testovaná látka je po expoziční dobu 24 hodin udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovanou plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou immobilizaci však nelze doporučit. Jako alternativní metody je možno použít " ochranného límce“.

Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo s použitím jiného vhodného způsobu očištění pokožky.

Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání. Pozorování zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelné prohlížení zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

Na konci pokusu se u všech zvířat včetně kontrolních provedou následující vyšetření:

Mezi další charakteristiky, které mohou být potřebné pro úplné toxikologické hodnocení patří stanovení: vápníku, fosforu, chloridů, sodíku, draslíku, glukózy na lačno, lipidů, hormonů, acidobasické rovnováhy, methemoglobinu, aktivity cholinesterasy.

Další biochemické analýzy mohou být v případě potřeby použity pro studium širšího spektra účinků.

U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva. Aspoň játra, ledviny, nadledviny, plíce a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání. Orgány a tkáně např. normální a exponovaná kůže, játra, ledviny, slezina, varlata, nadledviny, srdce i všechny orgány s makroskopickými lézemi nebo změnami velikosti) je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na pozdější histopatologická vyšetření.

U všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny, je třeba provést histologické vyšetření uchovaných orgánů a tkání. Pokud se v orgánech a tkáních ve skupině s nejvyšší dávkou, objeví poškození způsobená testovanou látkou, je nutno provést histologické vyšetření těchto tkání i u všech skupin s nižšími dávkami. U zvířat satelitních skupin je třeba provést histologické vyšetření se zvláštním důrazem na orgány a tkáně, ve kterých se objevily účinky otravy u ostatních exponovaných zvířat.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s jednotlivými formami poškození.

Všechny zjištěné výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

Metoda je replikací OECD TG 473, In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test (1997).

Účelem analýzy chromozómových aberací in vitro je nalézt látky, jež v kulturách savčích buněk způsobují strukturální chromozómové aberace (1) (2) (3). Strukturální aberace jsou dvojího druhu: chromozómové a chromatidové. Aberace vyvolané chemickými mutageny jsou většinou chromatidové, dochází však též k aberacím chromozómového typu. Vznik polyploidie může naznačovat, že daná chemická látka je schopna vyvolávat numerické aberace. Tato metoda však není navržena k analýze numerických aberací a běžně se k tomuto účelu nepoužívá. Chromozómové mutace a příbuzné jevy jsou příčinou řady genetických chorob u člověka a existují přesvědčivé doklady toho, že chromozómové mutace a příbuzné jevy, jež způsobují změny v onkogenech a tumorsupresorových genech somatických buněk, hrají úlohu při vzniku rakoviny u člověka a experimentálních zvířat.

Tento test se používá k odhalení možných savčích mutagenů a karcinogenů. Řada chemických látek, které jsou v tomto testu pozitivní, je sice pro sabce karcinogenní, není však dostatečná korelace mezi tímto testem a karcinogenitou. Tato korelace závisí na druhu látky a existuje stále více dokladů o tom, že existují chemické látky, jejichž karcinogenní vlastnosti se tímto testem nezjistí, protože zřejmě působí jiným mechanismem než přímým poškozením DNA

K analýze chromozómových aberací in vitro se mohou použít kultury stabilizovaných buněčných linií, buněčných kmenů nebo primární buněčné kultury. Použité buňky jsou vybrány na základě schopnosti růstu v kultuře, stability karyotypu, počtu chromozómů, jejich diverzity a četnosti spontánních chromozómových aberací.

Testy in vitro vyžadují obecně exogenní zdroj metabolické aktivace. Tento systém metabolické aktivace nedokáže dokonale napodobit podmínky u savců in vivo. Je třeba se vyvarovat podmínek, které by mohly vést k pozitivním výsledkům, jež neodrážejí vnitřní mutagenitu, nýbrž jsou způsobeny změnami pH, osmolality nebo vysokou cytotoxicitou (4) (5).

Aberace chromatidového typu: strukturální poškození chromozómu, které se projevuje jako zlom jedné, případně obou chromatid, nebo zlom a opětovné spojení mezi chromatidami.

Aberace chromozómového typu: strukturální poškození chromozómu vyjádřená jako zlom respektive jako zlom a opětovné spojení obou chromatid na stejném místě (zahrnuty jsou aberace typu dicentrický chromozóm, prsténčitý chromozóm-ring)

Zlom chromatidy: jako zlom lze hodnotit porušení kontinuity jedné nebo obou chromatid za předpokladu, že vzniklá mezera ve struktuře chromatidy je větší než je šířka poškozené chromatidy. Dále pak v případech, koncový (distální) fragment v místě zlomu je dislokovaný (nebo mimo osu chromatidy), případně jedna chromatida hodnoceného chromozómu je kratší v důsledku delece.

Endoreduplikace: proces, kde po S-fázi replikace DNA nepřechází jádro do mitózy, nýbrž začíná další S-fáze. Výsledkem jsou chromozómy s 4, 8, 16, ... chromatidami.

Gap: achromatická léze menší než šířka jedné chromatidy a s minimálním vybočením chromatid.

Mitotický index: poměr buněk v metafázi dělený celkovým počtem buněk v dané populaci buněk; udává stupeň proliferace této populace.

Numerická aberace: změna počtu chromozómů oproti normálnímu počtu charakteristickému pro použité buňky.

Polyploidie: násobek haploidního počtu chromozómů (n) jiný než diploidní počet (tedy 3n, 4n atd.).

Strukturální aberace: změna chromozómové struktury zjistitelná mikroskopickou analýzou buněčného dělení ve stádiu metafáze, pozorovaná jako delece a fragmenty a výměny.

Buněčné kultury se vystaví působení testované látky, a to s metabolickou aktivací a bez ní. Ve stanovených intervalech po expozici buněčné kultury testované látce, se metafáze zastaví například Colcemidem® nebo kolchicinem, buňky se sklidí, obarví se a v metafázických buňkách se mikroskopicky zjišťují chromozómové aberace.

Je možno použít celou řadu buněčných linií, kmenů nebo primárních buněčných kultur, včetně buněk lidských (například fibroblasty čínského křečka nebo lymfocyty periferní krve člověka či jiného savce).

K udržování kultur je třeba používat vhodná kultivační média a inkubační podmínky (kultivační nádoby, koncentrace CO₂, teplota a vlhkost). U buněčných linií a kmenů je třeba běžným způsobem kontrolovat stabilitu modálního počtu chromozómů a nepřítomnost mykoplasmat v buňkách. V případě kontaminace se buňky nepoužívají.. Je třeba znát normální dobu buněčného cyklu a kultivační podmínky.

Stabilizované buněčné linie a kmeny: buňky se množí ze zásobních kultur vysetím do kultivačního média v takové hustotě, aby kultury nedosáhly konfluentní vrstvy před dobou sklízení a inkubují se při teplotě 37°C.

Lymfocyty: ke kultivačnímu médiu obsahujícímu mitogen (např. fytohemoglutinin) se přidá buď plná krev s vhodným antikoagulantem (např. heparinem), nebo separované lymfocyty získané od zdravých jedinců a kultivují se při teplotě 37°C.

Na buňky se testovanou látkou působí v přítomnosti i v nepřítomnosti vhodného metabolického aktivačního systému. Nejobvyklejší je kofaktory suplementovaná mitochondriální frakce (S9) připravená z jater hlodavců, ovlivněná činidly indukujícími enzymy jako je Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9), nebo směs fenobarbitalu a β-naftoflavonu(10)(11) (12).

Konečná koncentrace mitochondriální frakce v médiu činí obvykle 1 – 10 % v/v. Aktivita metabolického aktivačního systému bude záviset na tom, jakého typu je testovaná látka. V některých případech je vhodné použít mitochondriální frakci v několika koncentracích.

Pro účely endogenní aktivace mohou být použity i geneticky modifikované buněčné linie exprimující specifické aktivační enzymy. Výběr buněčných linií by měl být vědecky ověřen (např. vztahem isoenzymu cytochromu P450 k metabolismu testované látky).

Je-li testovaná látka v pevném stavu, látka se před působením na buňky rozpustí nebo se připraví její suspenze ve vhodném rozpouštědle a případně naředí. Kapalné testované látky se mohou do systému přidávat přímo nebo se předtím ředí. Je třeba používat čerstvé preparáty, ledaže údaje o jejich stabilitě prokazují, že delší skladování neovlivňuje jejich vlastnosti.

U zvoleného rozpouštědla nesmí existovat podezření, že by mohlo s testovanou látkou chemicky reagovat, a nesmí narušovat přežívání buněk a aktivitu S9. Používá-li se méně známé rozpouštědlo musí být podpořeno referencemi prokazujícími jeho kompatibilitu. Doporučuje se, aby všude tam, kde je to možné, bylo na prvním místě zvažováno použití jako rozpouštědla vody. Je-li testovaná látka ve vodě nestálá, musí být použité organické rozpouštědlo zcela bezvodé. Voda se dá odstranit molekulárním sítem.

Mezi kritéria, jež se uvažují při stanovování nejvyšší koncentrace, patří cytotoxicita, rozpustnost v systému a změny pH resp. osmolality.

Cytotoxicita se stanoví s metabolickou aktivací i bez ní v hlavním experimentu, přičemž se použije vhodné indikace buněčné integrity a růstu, například stupně konfluence, počet živých buněk, nebo mitotický index. Je vhodné stanovit cytotoxicitu a rozpustnost v předběžných experimentech.

Je třeba použít minimálně tři analyzovatelné koncentrace. Dochází-li k cytotoxicitě, musí tyto koncentrace pokrývat rozsah od maximální do nízké nebo nulové toxicity. To obvykle znamená, že se jednotlivé koncentrace nebudou lišit více než násobkem, který leží mezi hodnotami 2 a √10. V době sklízení buněk musí být při nejvyšší koncentraci pozorován signifikantní pokles konfluentního růstu, počtu buněk, nebo mitotického indexu (vždy o více než 50%). Mitotický index je pouze nepřímou mírou cytotoxických /cytostatických účinků a je závislý na době uplynulé po expozici testovanou látkou. Je však akceptovatelný pro suspenzní kultury, kde by jiná detekce toxicity byla obtížná a nepraktická. Jako doplňující informace je možno použít také údaje o kinetice buněčného dělení, jako je průměrný generační čas; ten ovšem představuje celkový průměr, který ne vždy odhalí existenci v dělení zpožděných subpopulací buněk. A tak i malé prodloužení průměrného generačního času může znamenat značný odklon od vhodné doby sklízení z hlediska optimálního výtěžku aberací.

U relativně necytotoxických látek činí maximální koncentrace testované látky nejnižší z hodnot 5 μl/ml, 5 mg/ml nebo 0,01 M.

U relativně nerozpustných látek, jež jsou netoxické v koncentracích nižších než je koncentrace při které se již látka nerozpouští, má být nejvyšší použitá koncentrace vyšší než je mez rozpustnosti ve finálním kultivačním médiu na konci kultivace s testovanou látkou. V některých případech – například dochází-li k toxickému účinku při koncentracích vyšších než je nejnižší nerozpustná koncentrace – se doporučuje testovat při několika koncentracích s viditelným srážením. Může být užitečné vyhodnotit rozpustnost na počátku a na konci působení, protože se během expozice může rozpustnost změnit v testovacím systému vlivem přítomnosti buněk, séra, S9 apod. Nerozpustnost se dá zjistit i prostým okem.. Sraženina nesmí být na překážku při hodnocení buněk.

Do každého experimentu, ať již s metabolickou aktivací nebo bez ní, je třeba zařadit souběžné pozitivní a negativní kontroly (rozpouštědlo, nebo vehikulum). Pokud se aplikuje metabolická aktivace, musí být pozitivní kontrolou látka vyžadující metabolickou aktivaci k vyvolání mutagenního účinku.

Pro pozitivní kontrolu se používá známý klastogen, a to při expozičních úrovních, kde se očekává, že poskytne reprodukovatelný a detekovatelný nárůst aberací nad pozadí, prokazující citlivost testovacího systému.

Koncentrace pro pozitivní kontrolu je třeba zvolit tak, aby účinek byl zřejmý, ale neodhaloval hodnotiteli přímo identitu zakódovaných preparátů. Mezi látky pro pozitivní kontrolu patří například:

Pro pozitivní kontrolu se mohou použít i jiné vhodné látky. Tam, kde je to možné, je vhodné použít pro pozitivní kontrolu látku ze stejné chemické skupiny.

Pro každý časový interval sklízení kultur je třeba použít i negativní kontrolu, ve které se používá rozpouštědlo nebo vehikulum v kultivačním médiu, zpracované stejným způsobem jako experimentální kultury. Mimoto je rovněž třeba zařadit kontrolu bez jakéhokoliv ovlivnění.

Na proliferující buňky se působí testovanou látkou za přítomnosti i nepřítomnosti metabolického aktivačního systému. Na lymfocyty je třeba začít působit asi 48 hodin po stimulaci mitogenem.

Obvykle se pro každou koncentraci používají dvě kultury; a totéž se doporučuje pro negativní kontroly s rozpouštědlem, nebo vehikulem. Pokud lze na základě historických údajů prokázat, že rozdíly mezi duplicitními kulturami jsou minimální (13) (14), je přijatelné, aby se pro každou koncentraci použila jenom jedna kultura.

V případě plynných nebo těkavých látek je třeba uplatnit v testu vhodné postupy, jako je použití neprodyšně uzavřených kultivačních nádob (15).

V prvním experimentu se buňky vystaví testované látce s metabolickou aktivací i bez ní po dobu 3 – 6 hodin a vzorky se odebírají v čase odpovídajícím zhruba 1,5-násobku normální délky buněčného cyklu od začátku expozice (12). Pokud jsou při použití aktivačního systému i bez něho výsledky negativní, provádí se další experiment bez aktivace, s kontinuální expozicí až do doby ukončení kultivace odpovídají zhruba 1,5-násobku normálního buněčného cyklu. Některé látky se hodnotí snáze při době expozice delší než je 1,5-násobek délky buněčného cyklu. Negativní výsledky s metabolickou aktivací se posuzují případ od případu. V případech, kdy se potvrzení negativních výsledků nepokládá za nutné, je třeba toto rozhodnutí zdůvodnit.

Na buněčné kultury se působí Colcemidem^® nebo kolchicinem obvykle po dobu 1 – 2 hodin před ukončením kultivace. Každá buněčná kultura se pro přípravu chromozómů zpracovává zvlášť. Příprava chromozómů sestává z ovlivnění buněk hypotonickým roztokem, fixace a obarvení.

Všechny preparáty, včetně pozitivních a negativních kontrol, se před mikroskopickou analýzou nezávisle zakódují. Jelikož fixační postupy často vedou k rozbití určitého podílu metafázických buněk a ztrátě chromozomů, musí být u všech typů buněk počet centromer v hodnocených buňkách roven modálnímu číslu ± 2. Pro každou koncentraci a kontrolu je třeba hodnotit minimálně 200 dobře rozprostřených metafází, stejnoměrně z obou kultur, pokud byly použity. V případě, že je počet aberací vysoký, může se počet analyzovaných metafází snížit.

I když účelem testu je zjistit strukturální chromozómové aberace, je také důležité zaznamenat případnou polyploidii a endoreduplikaci.

Jelikož experimentální jednotkou je buňka, je třeba vyhodnotit procento buněk se strukturálními chromozómovými aberacemi. Je třeba registrovat jednotlivé typy strukturálních aberací včetně jejich počtu a četnosti u experimentálních i kontrolních kultur. Gapy se zaznamenávají zvlášť, ale obvykle se do celkové četnosti aberací nezahrnují.

Současně je třeba v testu zaznamenávat také zjištěnou cytotoxicitu v experimentálních i kontrolních kulturách.

Udávají se data pro jednotlivé kultury. Nakonec se všechna data uvedou v sumární tabulce.

Verifikace zjevně pozitivních výsledků se nepožaduje. Nejednoznačné výsledky se objasňují dalším testováním, nebo modifikací experimentálních podmínek. O nutnosti potvrdit negativní výsledky bylo pojednáno v odst. 1.4.3.3 V následných experimentech je třeba zvážit modifikaci použitých parametrů tak, aby se rozšířil rozsah posuzovaných podmínek. K parametrům, které lze modifikovat, patří koncentrační intervaly a podmínky metabolické aktivace.

Ke zjišťování pozitivního výsledku se používá několik kritérií, například na koncentraci testované látky závislá frekvence buněk s chromozómovými aberacemi. Nejprve je třeba uvážit biologickou významnost výsledků. Při vyhodnocování výsledků testu se mohou použít statistické metody (3) (13). Statistická významnost by však neměla být jediným určujícím faktorem pozitivního výsledku.

Nárůst počtu polyploidních buněk může indikovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat mitotické procesy a vyvolávat numerické chromozómové aberace. Nárůst počtu buněk s endoreduplikovanými chromozómy může naznačovat, že testovaná látka má schopnost inhibovat fáze buněčného cyklu (17) (18).

Testovaná látka, při jejímž použití výsledky nesplňují výše uvedená kritéria, se v tomto systému považuje za nemutagenní.

Ačkoliv většina experimentů vykazuje jasně pozitivní, nebo negativní výsledky, ve výjimečných případech získaná data nedovolují jednoznačné posouzení účinku testované látky. Výsledky mohou být nejisté, nebo diskutabilní bez ohledu na počet opakovaných experimentů. Pozitivní výsledky testu na chromozómové aberace in vitro ukazují, že testovaná látka vyvolává v kultuře savčích somatických buněk strukturální chromozómové aberace. Negativní výsledky ukazují, že za daných experimentálních podmínek testovaná látka v kultuře savčích somatických buněk chromozómové aberace nevyvolává.

U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza/ příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, průdušnice a plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní, a (slzné žlázy). Tkáně v závorkách se posuzují v případě, pokud lze na jejich postižení usuzovat z příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s poškozením a procentuelně počet zvířat s jednotlivými typy poškození. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

Testovaná látka se podává denně orálně po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat (nehlodavcům), a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Testovanou látku lze podávat v potravě nebo může být vhodnější podávání v kapslích. Mohou být použity také jiné způsoby orální aplikace. Všem zvířatům se testovaná látka podává po celou dobu pokusu stejnou metodou. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

Obvykle se jako živočišný druh - nehlodavec používá pes: dává se přednost definovanému plemeni. Je možno používat i jiných druhů nehlodavců. Je třeba pracovat na mladých zdravých zvířatech; v případě psů se má s podáváním začít ve věku od 3 do 6 měsíců a ne starším než 9 měsíců. Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a plemeno.

Pro každou úroveň dávek použít nejméně 8 zvířat (4 samice a 4 samci). Počet zvířat na konci pokusu musí být takový, aby umožnil vyhodnocení toxických účinků.

Je třeba použít nejméně tři úrovně dávek a jednu kontrolní skupinu. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší úroveň dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí. Nejnižší úroveň dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední úroveň dávky měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně dávek, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky.

Ve skupině s nízkou a střední úrovní dávky a v kontrolní skupině by k uhynutí rovněž nemělo docházet.

Podává-li se málo toxická látka v potravě, je třeba zajistit, aby ani aplikované množství ani další vlastnosti testované látky nebránily normální výživě zvířat.

Podává-li se testovaná látka v potravě, může se použít buď konstantní koncentrace (v ppm nebo mg.kg^-1 potravy) nebo konstantní dávkování ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete; použitou alternativu je třeba uvést. Podává-li se látka přímo, například v kapslích, mělo by se tak dít každý den ve stejnou dobu, a dávkování v týdenních intervalech přizpůsobovat změnám tělesné hmotnosti zvířete.

Provádí-li se subchronický orální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejná dieta.

Provede-li se 90denní test níže popsanou metodou a nevyvolá-li aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 tělesné hmotnosti za den (nebo dávky vyšší - odpovídající možné expozici člověka, je-li tato známa) žádné toxické účinky, je možno od dalšího testování upustit. Podává-li se málo toxická látka v potravě, je třeba zajistit, aby ani aplikované množství ani další vlastnosti testované látky nebránily normální výživě zvířat.

Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky, jejich dobu objevení, stupeň a trvání. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

V ideálním případě se zvířatům podává testovaná látka 7 dní v týdnu po dobu 90dnů. Podává-li se látka jiným způsobem než v potravě, považuje se za přijatelné podávat látku 5 dní v týdnu.

Pozorování zahrnuje (ale není na ně omezeno) změny kůže, srsti, očí, sliznic, dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování.

Příjem potravy (a příjem vody při podávání testované látky v pitné vodě) a hmotnost zvířat se zaznamenávají týdně.

Nejméně jednou denně je třeba provádět pečlivá klinická vyšetření s vhodnými opatřeními k minimalizaci ztrát zvířat pro studii. Po skončení studie se pitvají všechna zvířata, která přežila. Umírající zvířata je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

U všech zvířat včetně kontrolních se obvykle provedou následující vyšetření:

U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza, příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, (průdušnice), plíce, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), žlučník, jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, representativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), a (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.

Úplné histopatologické vyšetření orgánů a v tkání je třeba provést u všech zvířat skupiny, které byla podána nejvyšší dávka, a u zvířat kontrolní skupiny. Histopatologické vyšetření zvířat z dalších dávkových skupin se provede na orgánech, u kterých byla nalezena poškození u skupiny s nejvyšší dávkou, nebo když je to indikováno na základě klinických pozorováni.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s poškozením, typy poškození a procentuálně počet zvířat s jednotlivými typy poškození. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

Testovaná látka se aplikuje denně na kůži po 90 dní v odstupňovaných dávkách několika skupinám pokusných zvířat, a to každé skupině jedna úroveň dávky. Během období podávání se zvířata denně pozorují, aby se zjistily příznaky toxicity. Zvířata, která uhynou během pokusu, i zvířata, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin.

Krátce před začátkem pokusu se ostříhá srst na zádech pokusných zvířat. Vyholení srsti je rovněž možné, mělo by se však provést cca 24 hodin před experimentem. Ostříhání nebo oholení je potřeba opakovat každý týden. Při střihání nebo holení srsti je třeba dbát na to, aby se nepoškodila kůže (např. abrazí). Pro nanášení se připraví nejméně 10 % povrchu těla. Je třeba vzít v úvahu hmotnost zvířat při rozhodování o velikosti připravované plochy kůže a o velikosti krycího obvazu.

Při pokusech s tuhými látkami, které mohou být případně upraveny do práškové formy, je třeba zkoušenou látku dostatečně navlhčit vodou, případně vhodným vehikulem, aby byl zaručen dobrý kontakt s kůží. Testované kapaliny se zpravidla aplikují neředěné. Látka se nanáší denně 5 až 7 dnů v týdnu.

Je možno použít dospělé potkany, králíky nebo morčata, případně i jiné zvířecí druhy, jejich použití však musí být odůvodněné. Na začátku studie by nemělo variační rozpětí hmotnosti zvířat (pro každé pohlaví zvlášť) překročit ± 20% střední hodnoty. Provádí-li se subchronický dermální test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný živočišný druh a kmen.

Pro každou úroveň dávek použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců) se zdravou kůží. Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno podávat další skupině (satelitní skupině) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší dávku a během následujících 28 dnů po podávání sledovat vratnost, přetrvávání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.

Je třeba použít nejméně tři hladiny dávek a jednu kontrolní skupinu nebo - pokud se použilo vehikula - kontrolní skupinu s aplikací vehikula. Doba expozice má být nejméně 6 hodin denně. Nanášení testované látky by se mělo provádět každý den ve stejnou dobu. V intervalech týdenních nebo čtrnáctidenních je třeba aplikovanou dávku přizpůsobovat tak, aby se udržovala stálá hladina dávky ve vztahu k tělesné hmotnosti zvířete. S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Používá-li se vehikulum pro usnadnění aplikace, podává se kontrolní skupině stejným způsobem jako pokusným skupinám, a to ve stejném množství, které obdrží skupina, které se aplikuje nejvyšší dávka.

Nejvyšší hladina dávky má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen v malém počtu. Nejnižší hladina dávky by neměla vyvolat žádné příznaky toxicity. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší dávka tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední hladina dávky měla vyvolat jen toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 hladiny dávek, mají být vmezeřené dávky voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední hladinou dávky a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

Vede-li aplikace testované látky k těžkému podráždění kůže, je třeba snížit koncentraci, což u vysoké dávkové hladiny může vést k omezení nebo vyloučení ostatních toxických účinků. Došlo-li k těžkému poškození kůže, je dokonce za určitých okolností nutno pokus ukončit a provést jej znova s nižšími koncentracemi.

Nevyvolá-li při předběžné studii aplikace dávky 1000 mg.kg^-1 nebo vyšší dávky, která odpovídá možné expozici člověka, žádné toxické účinky, není další zkouška nutná.

Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

Zvířata se chovají v klecích po jednom. Exponují se studované látce nejlépe 7 dnů v týdnu po dobu 90 dnů. Zvířata satelitní skupiny, která jsou určena pro následné pozorování, je třeba chovat po dalších 28 dnů bez expozice, aby se mohla pozorovat reparace toxických účinků nebo jejich přetrvávání. Doba expozice činí nejméně 6 hodin denně.

Testovanou látku je třeba nanášet rovnoměrně na celou plochu, která představuje asi 10 % povrchu těla, u vysoce toxických látek může být tato plocha menší. Látkou je třeba pokrýt co největší část pokusné plochy rovnoměrně v co nejtenčí vrstvě.

Testovaná látka je po expoziční dobu udržována v kontaktu s kůží pomocí porézního mulového obvazu a nedráždivé náplasti. Testovací plochu je dále třeba vhodným způsobem překrýt, aby se mulový obvaz a testovaná látka fixovaly a aby se zabránilo orálnímu příjmu. K zamezení požití látky je možno použít i prostředků pro omezení volnosti pohybu, úplnou imobilizaci však nelze doporučit.

Po uplynutí doby expozice se odstraní zbytky testované látky, pokud možno vodou nebo jiným způsobem vhodným k očištění pokožky.

Všechna zvířata je třeba denně pozorovat a zaznamenávat příznaky otravy včetně jejich počátku, stupně a trvání.

Pozorování v kleci zahrnuje změny srsti, kůže, očí a sliznic, a také dýchání a krevního oběhu, změny funkce autonomní a centrální nervové soustavy, somatomotorické aktivity a chování. Hmotnosti zvířat se zaznamenávají týdně. Doporučuje se zaznamenávat týdně i spotřebu potravy. Je třeba zajistit pravidelnou kontrolu zvířat, aby pokud možno nedocházelo ke ztrátám zvířat jako např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chybného zařazení. Po skončení studie se všechna zvířata, která přežila, s výjimkou satelitních skupin, pitvají. Umírající zvířata a zvířata v těžkém stresu či trpící bolestí je třeba okamžitě vyřadit, humánně utratit a pitvat.

U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:

Pokud nejsou přiměřená historická kontrolní data, má se uvážit stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem aplikace.

U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny včetně jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, podvěsek mozkový, štítná žláza, příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, (průdušnice), plíce, srdce, aorta, (slinné žlázy), játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, přídatné pohlavní orgány, žlučník (je-li přítomen), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, representativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), (hrudní kost s kostní dření), (kost stehenní včetně kloubních ploch), (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní), a (slzné žlázy). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s lézemi a procentuálně počet zvířat

s jednotlivými typy lézí. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

Několik skupin pokusných zvířat je exponováno studované látce denně po určitou dobu, v odstupňovaných koncentracích, každá skupina jedné koncentraci, a to po 90 dnů. Použije-li se pro dosažení potřebné koncentrace testované látky v atmosféře vehikulum, je třeba použít kontrolní skupinu pro vehikulum. Během trvání pokusu se zvířata denně pozorují a zjišťují se příznaky toxických účinků. Zvířata, která během pokusu uhynou, i ta, která přežijí do konce pokusu, se pitvají.

Nejméně 5 dní před testem jsou zvířata chována v podmínkách chovu a krmení, v jakých budou během experimentu. Před testem se zdravá mladá zvířata náhodně přiřadí do jednotlivých experimentálních skupin. Pokud je třeba, přidá se k testované látce vhodné vehikulum tak, aby v ovzduší vznikla příslušná koncentrace testované látky. Pokud se užije pro usnadnění aplikace vehikulum nebo jiná aditiva, musí být o nich známo, že nemají toxický účinek. Existují-li vhodná historická data, je možno je využít.

Dává se přednost potkanům, pokud nejsou známy důvody proti tomu. Pracuje se na mladých zdravých zvířatech z běžně užívaných pokusných kmenů. Na začátku studie nemá variační rozpětí hmotnosti zvířat překročit ± 20 % střední hodnoty. Provádí-li se subchronický inhalační test jako předběžný test před dlouhodobým testem, v obou studiích se má použít stejný druh a kmen.

Pro každou úroveň koncentrace je třeba použít nejméně 20 zvířat (10 samic a 10 samců). Samice musí být nullipary a nesmí být březí. Pokud se zvířata budou zabíjet v průběhu studie, je nutno zvýšit celkový počet zvířat o počet zvířat, která budou zabita před koncem pokusu. Mimoto je možno exponovat další skupinu (satelitní skupinu) 20ti zvířat (10 zvířat každého pohlaví) po dobu 90dnů nejvyšší koncentraci a během následujících 28 dnů po ukončení expozic sledovat vratnost, trvání nebo zpožděný výskyt toxických účinků.

Použijí se nejméně tři skupiny s různou úrovní koncentrace a jedna kontrolní skupina (případně kontrolní skupina s vehikulem - pokud se použije - v koncentraci stejné jako u skupiny s nejvyšší koncentrací testované látky). S výjimkou aplikace testované látky se se zvířaty v kontrolní skupině zachází stejně jako s pokusnými. Nejvyšší koncentrace má vyvolat toxické účinky, ale nezpůsobit žádné uhynutí nebo jen

v malém počtu. Pokud existují odhady expozice u člověka, má nejnižší koncentrace tuto hodnotu překračovat. Ideálně by střední koncentrace měla vyvolat toxický účinek na hranicích zjistitelnosti. Aplikují-li se více než 3 úrovně koncentrací, mají být voleny tak, aby vyvolaly odstupňované toxické účinky. Ve skupině s nízkou a střední koncentrací a v kontrolní skupině by počet uhynutí měl být nízký, jinak je vyhodnocení výsledků obtížné.

Zvířata se exponují po dobu 6 hodin od ustavení rovnováhy koncentrace studované látky. V případě specifických požadavků je možné použít i jiných dob expozice.

Pro expozici zvířat se používá dynamické inhalační zařízení, které zaručuje proudění vzduchu s výměnou nejméně 12krát za hodinu, aby byl zaručen přiměřený obsah kyslíku a rovnoměrné rozdělení látky v expoziční atmosféře. Použije-li se expoziční box, je třeba ho konstruovat tak, aby co nejvíce bránil shlukování zvířat a aby inhalační expozice testované látce byla co nejvyšší. Pro zajištění stability atmosféry

v inhalačním boxu neměl by v zásadě celkový objem pokusných zvířat přesáhnout 5 % objemu boxu. Je možné použít inhalační expozice orálně-nasální, samotné hlavy nebo individuální celotělové expozice; první dva způsoby expozice minimalizují příjem látky jinými cestami.

Pokusná zvířata je třeba denně pozorovat během celého období expozic i zotavení a zaznamenávat toxické účinky. Je třeba zaznamenat dobu uhynutí a čas, ve kterém se objeví a opět odezní toxické účinky.

Zvířata se exponují testované látce denně, 5 - 7 dnů v týdnu, po dobu 90 dnů. Zvířata v satelitních skupinách, která jsou určena k následnému pozorování, jsou pozorována dalších 28 dnů bez aplikace, k posouzení zotavení z otravy nebo přetrvávání toxických účinků. Teplota během experimentu má být 22 °C ± 3 °C. Relativní vlhkost má být mezi 30 % a 70 %, s výjimkou případů, kde to není možné (např. experimenty s aerosoly). Během expozice se nepodává potrava ani voda.

Používá se dynamický inhalační systém s vhodnou analytickou kontrolou koncentrace. Doporučuje se provést předběžný pokus pro získání potřebných koncentrací. Rychlost průtoku vzduchu je třeba nastavit tak, aby podmínky v celém expozičním boxu byly stejné. Systém musí zaručovat, že stabilních podmínek expozice bude dosaženo co nejrychleji.

Měření nebo monitorování podmínek expozice:

U všech zvířat včetně kontrolních se běžně provádějí následující vyšetření:

Pokud nejsou přiměřená dřívější kontrolní data, má se uvážit stanovení hematologických a biochemických parametrů ještě před začátkem expozic.

U všech zvířat použitých ve studii se provede pitva zahrnující zevní prohlídku povrchu těla, všech tělních otvorů, lební, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Játra, ledviny, nadledviny, štítná žláza (s příštítnými tělísky) a varlata se co nejdříve po sekci zváží ve vlhkém stavu, aby se předešlo vysychání.

Následující orgány a tkáně je třeba přechovávat ve vhodném médiu s ohledem na možná pozdější histopatologická vyšetření: všechny tkáně s makroskopickým postižením, plíce ( mají se vyjmout neporušeny, zvážit a fixovat vhodným médiem, tak aby se zachovala struktura plic - perfusní fixace se považuje za vhodnou), tkáň nasofaryngu, mozek - v řezech medula/pons, kůra mozku a mozečku, hypofýza, štítná žláza/příštítná tělíska, tkáň na místě brzlíku, průdušnice, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, slinivka břišní, varlata a vaječníky, děloha, (přídatné pohlavní orgány), (kůže), žlučník (je-li přítomen), jícen, žaludek, dvanácterník, tenké, tlusté a slepé střevo, konečník, močový měchýř, reprezentativní lymfatické uzliny, (samičí mléčná žláza), (stehenní sval), periferní nerv, (oči), hrudní kost s kostní dření, (kost stehenní včetně kloubních ploch), (páteřní mícha ve třech úrovních - krční, střed hrudní a bederní). Tkáně v závorkách se posuzují pokud je to indikováno podle příznaků toxicity nebo pokud souvisejí s cílovým orgánem.

s vysokou koncentrací.

Údaje se sestaví do tabulky. Z ní musí být pro každou experimentální skupinu patrný počet zvířat na počátku pokusu a počet zvířat s lezemi, typ leze a procentuálně počet zvířat s jednotlivými typy lézí. Výsledky je třeba vyhodnotit vhodnou statistickou metodou. Je k tomu možno použít kteroukoliv uznávanou statistickou metodu.

Zpráva o průběhu pokusu má pokud možno obsahovat tyto informace:

Testovaná látka je podávána normálně sedm dní v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po exposici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity.

Zvířata jsou chována při standardních podmínkách aspoň 5 dní před započetím testu. Před testem jsou zdravá, mladá zvířata náhodně rozdělena do exponovaných a kontrolních skupin.

Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce nebo jiné). Je třeba použít zdravé a mladé jedince běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Exposice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.

Pro každou úroveň dávky je třeba použít nejméně 40 zvířat (20 samic a 20 samců), stejně i pro kontrolní skupinu. Samice by měly být nullipary a neměly by být březí. Pokud je záměrem utratit některá zvířata před dokončením testu, je třeba použít přiměřeně vyšší počet zvířat.

V případě jiných druhů zvířat (nehlodavců) je možné použít menší počet zvířat, ale ne méně než 4 od každého pohlaví ve skupině.

Je třeba použít aspoň tři dávky a jednu kontrolní skupinu. Nejvyšší dávka by měla vyvolat jasné projevy toxicity bez nadměrné úmrtnosti. Nejnižší dávka by neměla vyvolat prokazatelné projevy toxicity. Střední dávky by měly být voleny ve středním pásmu mezi vysokými a nízkými dávkami. Výběr dávek by měl vzít v úvahu výsledky předchozích studií.

Obvykle jsou zvířata exponována denně. V případě, že testovaná látka je podávána v pitné vodě nebo v potravě, je třeba zajistit, aby k ní měla zvířata stálý přístup.

Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu k exponované skupině, vyjma exposice testované látce.

Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.

Dva hlavní způsoby aplikace jsou orální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobném způsobu exposice člověka.

Použití dermální aplikace vyvolává značné technické problémy. Chronická systémová toxicita v důsledku kožního vstřebání může být normálně odvozena z výsledku orálního testu a znalosti rozsahu kožního vstřebávání, odvozené z předchozích testů kožní toxicity.

Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.

Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování pět dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat “abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.

Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.

Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace šest hodin denně po pět dnů v týdnu (přerušovaná exposice), nebo v návaznosti na možnou exposici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.

Volba přerušované nebo kontinuální exposice závisí na cílech studia a na lidské exposici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální exposice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během exposice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.

Exposiční komory

Zvířata se exponují v inhalačních komorách jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma exposice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnou 5 % objemu komory.

Měření nebo monitorování zahrnuje:

Expozice látce by měla trvat nejméně 12 měsíců.

Pečlivé klinické sledování by mělo být prováděno nejméně jednou denně. Dodatečná pozorování by měla být prováděna denně s odpovídajícími zákroky k minimalizaci ztráty zvířat ze studie, např. pitva nebo uložení do lednice u zvířat, která jsou nalezena mrtvá a isolace nebo utracení zvířat, která jsou slabá nebo moribundní. Zvířata je třeba pečlivě sledovat, aby se spolehlivě zachytil začátek a progrese všech toxických účinků, a také za účelem minimalizace ztrát v důsledku nemocí, autolýzy nebo kanibalismu.

Registrují se klinické příznaky včetně neurologických a očních změn u všech zvířat, a dále případy uhynutí. Zaznamenává se doba objevení a postup toxických příznaků včetně podezření na tumor.

Hmotnost se zaznamenává individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období. Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné váhy ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.

Hematologická vyšetření (např. obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erythrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo jiné ukazatele srážlivosti) by měla být prováděna za tři měsíce, šest měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci na vzorcích krve shromážděných od všech nehlodavců resp. od 10 potkanů na pohlaví z každé skupiny. Tam kde je to možné, vzorky ve všech intervalech by měly být od stejných potkanů. Navíc by měl být odebrán vzorek před testem od nehlodavců.

Pokud klinické vyšetření zvířat naznačí zhoršený zdravotní stav zvířat během studie, měl by být stanoven diferenciální obraz bílých krvinek.

Diferenciální obraz bílých krvinek se vyšetří ve vzorcích od zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, vyšetří se i u skupiny s dávkou nejblíže nižší.

Vzorky moči 10 potkanů každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:

V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech nehlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví v každé skupině, pokud možno pro tytéž potkany ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:

Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v moribundním stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné tumory nebo léze, nebo léze, které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Mělo by být provedeno porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.

Všechny orgány a tkáně by měly být uchovány pro histopatologické vyšetření. To se obvykle týká následujících orgánů a tkání: mozku³ (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsku mozkového, štítné žlázy a příštítných tělísek, thymu, trachey a plic, srdce, aorty, slinných žlaz, jater³, sleziny, ledvin³, nadledvinek³, jícnu, žaludku, dvanácterníku, jejuna, ilea, slepého střeva, tračníku, konečníku, močového měchýře, lymfatických uzlin, slinivky, gonád³, akcesorních pohlavních orgánů, samičí mléčné žlázy, kůže, svaloviny, periferního nervu, míchy (krční, hrudní a bederní), sterna s kostní dření a stehenní kosti včetně kloubů, a očí. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích, je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.

Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k disposici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.

Všechny viditelné změny, zvláště tumory a jiné léze vyskytující se v kterémkoli orgánu, mají být zkoumány mikroskopicky. Navíc jsou doporučeny následující postupy:

Údaje by měly být sumarizovány ve formě tabulek, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat vykazujících léze a procento zvířat vykazujících jednotlivé typy lézí. Výsledky by měly být vyhodnoceny odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.

Zpráva o testu bude, pokud možno, obsahovat následující informace:

Testovaná látka se podává v odstupňovaných dávkách nebo koncentracích několika skupinám březích pokusných zvířat, jedna dávka na každou skupinu, alespoň v tom období březosti, ve kterém dochází k organogenezi. Krátce před očekávaným datem porodu jsou březí samice utraceny a jejich děloha i s obsahem je použita k dalšímu studiu. Tato testovací metoda zahrnuje studium embryo- a fetotoxicity.

Mladé, dospělé samice, které nikdy nebyly březí, stejného věku a velikosti jsou aklimatizovány při laboratorních podmínkách aspoň 5 dní před započetím testu. Potom jsou připuštěni samci s ověřenou plodností. Oplozené samice jsou náhodně rozděleny do experimentálních skupin.

Oplodnění může být zajištěno přirozenou cestou nebo umělou inseminací. Testovaná látka je podávána samicím denně. Aplikace začíná časně po implantaci a pokračuje během období organogeneze. Den před termínem jsou plody vyjmuty hysterektomií a podrobeny sledování abnormalit skeletu a vnitřních orgánů včetně sledování možnosti zpomaleného růstu, opožděné osifikace a krvácení do střeva.

Běžně používanými druhy jsou potkan, myš, křeček a králík. Preferovanými druhy jsou potkan a králík. Je třeba používat všeobecně zavedené kmeny. Používaný kmen by neměl mít nízkou plodnost a měly by být u něj známy reakce na teratogeny. Zvířata jsou chována jednotlivě.

Pro každou dávku je třeba použít aspoň 20 březích potkanů, myší nebo křečků nebo 12 březích králíků. Ke sledování teratogenního potenciálu studované látky je třeba zajistit dostatečný počet vrhů a mláďat.

Je třeba použít aspoň tři dávky a jednu kontrolní skupinu. V případě, že je testovaná látka podána ve vehikulu, je třeba zahrnout do studie i skupinu, které bylo podáno samotné vehikulum. Je třeba také znát toxikologické vlastnosti vehikula: nesmí být teratogenní ani mít vliv na reprodukční schopnosti. Se zvířaty v kontrolní(ch) skupině(ách) se zachází stejným způsobem jako se zvířaty v testovací skupině s výjimkou aplikace testované látky. Pokud to fyzikálně chemické nebo biologické vlastnosti dovolují, pak nejvyšší dávka testované látky by v ideálním případě měla u matek vyvolat takové projevy toxicity, jako je mírné snížení váhy, ale už ne více jak 10 % úmrtí. Nízká úroveň dávek by neměla vyvolat viditelné účinky. Střední dávky by měly být voleny tak, aby byly geometricky rozloženy mezi nízkou a vysokou dávku.

V případě, že látka s nízkou toxicitou při dávce nejméně 1000 mg.kg^-1 prokazatelně nevyvolá projevy embryotoxicity ani teratogenicity, není třeba testovat na jiných úrovních dávek.

Nultým dnem testu je den, kdy je pozorována vaginální zátka a/nebo spermie (pokud možno). Doba aplikace by měla zahrnovat období hlavní organogeneze. Za toto období je možno považovat 6. až 15. den u potkana a myši, 6. až 14. den u křečka a 6. až 18. den u králíka. V případě, že je za nultý den považován den, kdy bylo pozorováno páření nebo byla provedena umělá inseminace, je třeba připočítat k předchozím údajům jeden den. Podle jiné alternativy končí aplikace jeden den před očekávaným porodem.

Každý den je třeba provést pečlivé klinické vyšetření. Další sledování a opatření jsou prováděna za účelem minimalizace ztrát během studie.

Testovaná látka je aplikována orálně sondou, denně ve stejnou dobu.

Testovaným samicím se testovaná látka podává denně během příslušného období testu. Dávka může být vztažena na váhu samic na počátku podávání látky nebo, vzhledem k rychlému nárůstu hmotnosti během březosti, zvířata mohou být periodicky vážena a dávka upravována podle posledního vážení. Všechny známky toxicity je třeba ihned zaznamenat včetně doby nástupu, stupně a trvání. Samice vykazující známky potratu nebo předčasného porodu je třeba utratit a řádně makroskopicky vyšetřit. V pozorování je třeba pokračovat i po ukončení podávání látky až do doby přibližně jeden den před porodem. Hlavním účelem je postihnout většinu období březosti, ale vyhnout se komplikacím při interpretaci výsledků po přirozeném porodu. Pozorování zvířat v kleci by mělo zahrnovat přinejmenším změny kůže a srsti, očí a sliznic, dále dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování. Každý týden je třeba měřit spotřebu potravy a vážit zvířata.

Pokud dojde k uhynutí během nebo na konci studie je třeba u samic makroskopicky vyšetřit na morfologické abnormity nebo patologické změny, které mohly mít vliv na průběh březosti. Ihned po smrti je třeba odstranit dělohu a její obsah vyšetřit s ohledem na úmrtí embryí a zárodků a zjistit počet živých zárodků. Obvykle je možné určit dobu úmrtí zárodků v děloze. U potkanů a králíků je možné stanovit počet žlutých tělísek. Je třeba určit pohlaví zárodků a zaznamenat váhu jednotlivých zárodků a vypočítat průměr. Po vyjmutí je třeba jednotlivě zevně vyšetřit každý zárodek. U potkanů, myší a křečků je třeba vyšetřit kosterní abnormity u zhruba jedné třetiny až poloviny vrhu a u zbytku vhodnými metodami vyšetřit abnormity měkkých tkání. U králíků je třeba každý zárodek důkladně vyšetřit pitvou z hlediska abnormit vnitřností a skeletu.

Údaje je třeba shrnout ve formě tabulky, udávající pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat, která zabřezla, počet a procento živých zárodků a zárodků s abnormalitami skeletu nebo měkkých tkání a vztah výskytu abnormit k příslušnosti k určitým vrhům. Výsledky se hodnotí vhodnou statistickou metodou. Je možno použít jakékoliv uznávané statistické metody.

Zpráva o testu by měla pokud možno obsahovat následující informace:

Testovaná látka je podávána obvykle sedm dní v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po exposici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity, zvláště vývinu tumorů.

Zvířata se chovají v pokusných podmínkách ustájení a krmení nejméně pět dní před započetím testu. Před testem se mladá zdravá zvířata náhodně rozdělí do kontrolních a exponovaných skupin.

Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce i nehlodavce). Používají se zdravá mladá zvířata z běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Exposice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.

Pro hlodavce se užije nejméně 100 zvířat (50 samic a 50 samců) pro každou úroveň dávky a souběžná kontrolní skupina. Samice by měly být nullipary a negravidní. Je-li plánováno průběžné utrácení zvířat, počty je třeba zvýšit o počet zvířat, která budou takto utracena před koncem studie.

Zvolí se při nejmenším tři dávkové úrovně kromě souběžné kontrolní skupiny. Nejvyšší dávková úroveň by měla vyvolat příznaky minimální toxicity, jako je mírný pokles váhových přírůstků (méně než 10%), bez podstatnějších změn normální doby dožití daných jinými účinky než tumory.

Nejnižší dávková úroveň by neměla interferovat s normálním růstem, vývojem a délkou života zvířete nebo vyvolat jakékoli známky toxicity. Obecně by neměla být nižší než 10% vysoké dávky. Střední dávku/dávky je třeba stanovit ve středním pásmu mezi vysokou a nízkou dávkou.

Volba dávkových úrovní by měla vzít v úvahu předchozí testy a studie toxicity.

Exposice se provádí obvykle denně. Je-li látka podávána v pitné vodě nebo přimíšena do potravy, měla by být stále k disposici.

Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu ks exponovanou skupinou, vyjma exposice testované látce.

Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.

Tři hlavní cesty aplikace jsou orální, dermální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobném způsobu exposice u člověka.

Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.

Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování pět dnů v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat “abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.

Aplikace přímo na kůži může být zvolena jako simulace hlavní cesty vstupu u člověka a jako modelový způsob vyvolání kožního poškození.

Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální instilace může být platnou alternativou v specifických situacích.

Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace šest hodin denně po pět dnů v týdnu (přerušovaná exposice), nebo v návaznosti na možnou exposici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.

Volba přerušované nebo kontinuální exposice závisí na cílech studia a na lidské exposici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální exposice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během exposice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.

Exposiční komory

Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísun kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma exposice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnout 5% objemu komory.

Měření nebo monitorování zahrnuje:

Trvání testu karcinogenity zahrnuje větší část normální doby života zvířate použitého pro test. Test by měl být ukončen v 18 měsících u myší a křečků a 24 měsících u potkanů. Nicméně, pro některé kmeny zvířat s delší dobou života resp. s nízkým spontánním výskytem tumorů, doba ukončení by měla být 24 měsíců pro myši a křečky a 30 měsíců pro potkany. Alternativně, ukončení takové prodloužené studie je přijatelné, když počet přežívajících u nejnižší dávky nebo v kontrolní skupině klesne na 25 %. Při ukončení testu, ve kterém je zřetelný sexuální rozdíl odpovědi, každé pohlaví se posuzuje zvlášť. Tam, kde uhyne předčasně jen skupina s vysokou dávkou ze zjevných toxických příčin, nemusí to nutně vést k ukončení celého testu, pokud ostatní skupiny nevykazují toxické projevy, které by činily problémy. Aby bylo možno uznat negativní výsledek testu, nesmí být ztráty použitelných údajů (autolýzou, kanibalismem nebo v důsledku chyb obsluhy) v žádné skupině větší než 10% a přežití ve všech skupinách nesmí být nižší než 50% v 18 měsících u myší a křečků a v 24 měsících u potkanů.

Denní pozorování zvířat v klecích zahrnuje změny kůže a srsti, očí a sliznic, jakož i dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování.

Pravidelná kontrola zvířat je nutná, aby se zabránilo ztrátám zvířat ze studie v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chyb v obsluze. Moribundní zvířata jsou utracena a pitvána.

Klinické příznaky a mortalita by měly být zaznamenány u všech zvířat. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vývoji tumorů: doba objevení, lokalizace, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného či hmatného tumoru se zaznamenává.

Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné váhy ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.

Tělesné hmotnosti se zaznamenávají individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období.

Pokud pozorování zvířat v klecích svědčí o zhoršeném zdravotním stavu zvířat během studia, je třeba vyšetřit diferenciální obraz bílých krvinek.

Za 12 měsíců, za 18 měsíců a před utracením zvířat se provede krevní nátěr ze všech zvířat. Diferenciál bílých krvinek se provede ve vzorcích ze zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, zvláště údaje získané před utracením, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, diferenciál se vyšetří i u skupiny s dávkou nejblíže nižší, než je vysoká dávka.

Kompletní pitva by měla být provedena u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena, protože byla nemocná. Všechny viditelné tumory nebo léze, nebo léze které by mohly být tumory, je třeba uchovat.

Následující orgány a tkáně by měly být uchovány ve vhodných médiích pro možné budoucí histopatologické vyšetření: mozek (včetně řezů prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsek mozkový, štítná žláza a příštítná tělíska, tkáň thymu, trachea a plíce, srdce, aorta, slinné žlázy, játra, slezina, ledviny, nadledviny, pankreas, gonády, děloha, akcesorní pohlavní orgány, kůže, jícen, žaludek, dvanácterník, jejunum, ileum, slepé střevo, tračník, konečník, močový měchýř, representativní lymfatická uzlina, samičí mléčná žláza, svalovina stehna, periferní nerv, sternum s kostní dření, stehenní kost včetně kloubu, mícha na třech úrovních (krční, střední hrudní a bederní) a oči.

Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální způsob uchování těchto tkání. Naplnění plic v inhalačních studiích je zásadní pro odpovídající histopatologické vyšetření. V inhalačních studiích by měl být uchován celý respirační trakt včetně nosní dutiny, hltanu a hrtanu.

Údaje se sumarizují ve formě tabulek, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat vykazujích tumory zjištěné během testu, doba jejich stanovení a počet zvířat s tumory při utracení. Výsledky se hodnotí odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.

Zpráva o testu bude, pokud možno, obsahovat následující informace:

Popis exposičního zařízení: včetně konstrukce, typu, rozměrů, zdroje vzduchu, systému pro vytváření částic a aerosolů, metody klimatizace, zneškodňování vzduchu vycházejícího z aparatury a způsobu umístění zvířat v expozičním boxu, pokud se používá. Dále je třeba popsat zařízení pro měření teploty, vlhkosti, a tam, kde je to žádoucí, stability koncentrace nebo velikosti částic aerosolu. Údaje o exposici: ve formě tabulky včetně průměrných hodnot a variability (např. směrodatná odchylka) a měly by zahrnovat:

Cílem kombinovaného testu chronické toxicity/karcinogenity je určit chronické a karcinogenní účinky látky u některého druhu savců po dlouhodobé exposici.

Pro tento účel je test karcinogenity doplněn alespoň jednou exponovanou satelitní skupinou a kontrolní satelitní skupinou. Dávka použitá pro tuto satelitní skupinu může být vyšší než nejvyšší dávka použitá při testu karcinogenity. Zvířata v testu karcinogenity jsou zkoumána jak na obecnou toxicitu, tak na karcinogenní odpověď. Zvířata v exponované satelitní skupině jsou testována na obecnou toxicitu.

Testovaná látka se podává obvykle sedm dní v týdnu, vhodnou cestou, několika skupinám pokusných zvířat, jedna dávka na skupinu, po větší část života zvířat. Během a po exposici testované látce jsou zvířata denně pozorována za účelem sledování projevů toxicity a vývoje tumorů.

Zvířata se chovají v pokusných podmínkách ustájení a krmení nejméně pět dní před započetím testu. Před testem se mladá zdravá zvířata náhodně rozdělí do kontrolních a exponovaných skupin.

Preferovaným druhem je potkan. Na základě předchozích studií je možno použít i další druhy (hlodavce i nehlodavce). Používají se zdravá mladá zvířata z běžně chovaných kmenů laboratorních zvířat. Exposice by měla být započata co nejdříve po odstavení mláďat. Na začátku studie by neměl rozdíl ve váze zvířat činit více než ± 20% od průměru. V případě, že vlastní studii předchází test subchronické orální toxicity, je třeba použít stejný druh a kmen v obou studiích.

Pro hlodavce se použije nejméně 100 zvířat (50 samic a 50 samců) na každou úroveň dávky a souběžná kontrolní skupina. Samice by měly být nullipary a negravidní. Je-li plánováno průběžné utrácení zvířat, počty se zvýší o počet zvířat, která budou takto utracena před koncem studie.

Exponovaná satelitní skupina (skupiny) pro hodnocení patologie jiné než jsou tumory by každá měla obsahovat 20 zvířat pro každé pohlaví, zatímco satelitní skupina kontrol by měla obsahovat 10 zvířat každého pohlaví.

Pro test karcinogenity se zvolí přinejmenším tři dávkové úrovně kromě souběžné kontrolní skupiny. Nejvyšší dávková úroveň by měla vyvolat příznaky minimální toxicity, jako je mírný pokles váhových přírůstků (méně než 10%), bez podstatnějších změn normální doby dožití daných jinými účinky než tumory. Nejnižší dávková úroveň by neměla interferovat s normálním růstem, vývojem a délkou života zvířete nebo vyvolat jakékoli známky toxicity. Obecně by neměla být nižší než 10% vysoké dávky. Střední dávku/dávky je třeba stanovit ve středním pásmu mezi vysokou a nízkou dávkou.

Při volbě dávkových úrovní by se měly vzít v úvahu předchozí testy a studie toxicity.

Pro účely testování chronické toxicity jsou v testu zahrnuty satelitní exponované skupiny a souběžná kontrolní satelitní skupina. Vysoká dávka pro exponovaná satelitní zvířata by měla vyvolat zřetelné příznaky toxicity.

Exposice se provádí obvykle denně. Je-li látka podávána v pitné vodě nebo přimíšena do potravy, měla by být stále k disposici.

Souběžná kontrolní skupina je identická v každém ohledu s exponovanou skupinou, vyjma exposice testované látce.

Ve zvláštních případech, jako jsou inhalační studie s aerosoly nebo použije-li se pro orální aplikaci emulgátoru, jehož biologická aktivita není charakterizována, zařadí se další negativní kontrolní skupina, která není exponována ani vehikulu.

Tři hlavní cesty aplikace jsou orální, dermální a inhalační. Volba způsobu podání závisí na fyzikálních a chemických charakteristikách testované látky a pravděpodobnému způsobu exposice u člověka.

Tam, kde se testovaná látka vstřebává z gastrointestinálního traktu a je-li požití jedna z cest, jimiž může být exponován člověk, dává se přednost orální aplikaci, pokud nejsou proti tomu nějaké důvody. Zvířata mohou dostat testovanou látku v potravě, rozpuštěnu v pitné vodě nebo podanou v tobolce.

Ideálně by se měla látka podávat sedm dní v týdnu, protože dávkování pět dní v týdnu může vést k vymizení toxicity nebo naopak vyvolat “abstinenční“ příznaky v období bez aplikace, a tudíž ovlivnit výsledky a následné hodnocení. Nicméně, především s ohledem na praktické aspekty, dávkování pětkrát týdně je považováno za přijatelné.

Aplikace přímo na kůži může být zvolena jako simulace hlavní cesty vstupu u člověka a jako modelový způsob vyvolání kožního poškození.

Protože inhalační studie jsou technicky komplikovanější než jiné způsoby aplikace, jsou zde uvedeny podrobněji informace o této cestě podání. Intratracheální insfilace může být platnou alternativou v specifických situacích.

Dlouhodobé expozice obvykle napodobují předpokládané lidské expozice, takže zvíře je obvykle exponováno po ustálení koncentrace šest hodin denně po pět dní v týdnu (přerušovaná exposice), nebo v návaznosti na možnou exposici v prostředí, 22-24 hodin denně po sedm dní v týdnu (kontinuální expozice), s přibližně jednou hodinou pro krmení zvířat denně ve stejnou dobu dne, použitou i pro čištění expozičního boxu. V obou případech jsou zvířata obvykle exponována fixním koncentracím testované látky. Hlavní rozdíl mezi přerušovanou a stálou expozicí je v tom, že v první má zvíře 17-18 hodin na ústup účinků denní expozice s ještě delším obdobím během víkendu.

Volba přerušované nebo kontinuální exposice zavisí na cílech studie a na lidské exposici, která má být simulována. Nicméně, je třeba vzít v úvahu určité technické obtíže. Na příklad, výhody kontinuální exposice pro simulaci podmínek zevního prostředí mohou být narušeny nutností pití a krmení během exposice a potřebou komplikovanější (a spolehlivé) generace aerosolu nebo určité koncentrace par a technik monitorování.

Exposiční komory

Zvířata se exponují v inhalačních komorách, jejichž konstrukce zaručuje dynamický proud pro nejméně 12 výměn vzduchu za hodinu, aby byl zajištěn dostatečný přísunu kyslíku a rovnoměrná distribuce expoziční atmosféry. Kontrolní a expoziční komory by měly mít identickou konstrukci, tak aby byly expoziční podmínky srovnatelné ve všech aspektech vyjma exposice testované látce. Uvnitř komory se obvykle udržuje mírný podtlak a tím se brání úniku testované látky do okolního prostředí. Komory by měly minimalizovat shlukování testovaných zvířat. Obecně by v zájmu udržení stabilní atmosféry v komoře objem zvířat neměl přesáhnou 5 % objemu komory.

Měření nebo monitorování zahrnuje:

Trvání testu karcinogenity zahrnuje větší část normální doby života zvířete použitého pro test. Test by měl být ukončen v 18 měsících u myší a křečků a 24 měsících u potkanů. Nicméně, pro některé kmeny zvířat s delší dobou života resp. s nízkým spontánním výskytem tumorů, doba ukončení by měla být 24 měsíců pro myši a křečky a 30 měsíců pro potkany. Alternativně, ukončení takové prodloužené studie je přijatelné, když počet přežívajících u nejnižší dávky nebo v kontrolní skupině klesne na 25 %. Při ukončení testu, ve kterém je zřetelný sexuální rozdíl odpovědi, každé pohlaví se posuzuje zvlášť. Tam, kde uhyne předčasně jen skupina s vysokou dávkou ze zjevných toxických příčin, nemusí to nutně vést k ukončení celého testu, pokud ostatní skupiny nevykazují toxické projevy, které by činily problémy. Aby bylo možno uznat negativní výsledek testu, nesmí být ztráty použitelných údajů (autolýzou, kanibalismem nebo v důsledku chyb obsluhy) v žádné skupině větší než 10% a přežití ve všech skupinách nesmí být nižší než 50% v 18 měsících u myší a křečků a v 24 měsících u potkanů.

Satelitní skupiny 20 dávkovaných zvířat pro každé pohlaví a 10 připojených kontrolních zvířat každého pohlaví použitých pro testování chronické toxicity by měly být v pokusu aspoň 12 měsíců. U těchto zvířat by mělo být plánováno utracení tak, aby umožnilo odlišení patologie, která má vztah k testované látce, od komplikujících projevů stárnutí.

Denní pozorování zvířat v klecích zahrnuje změny kůže a srsti, očí a sliznic, jakož i dýchacího, oběhového, autonomního a centrálního nervového systému, somatomotorické aktivity a chování.

U zvířat exponované satelitní skupiny (skupin) se provádí v přiměřených intervalech klinické vyšetření.

Pravidelná kontrola zvířat je nutná, aby se zabránilo ztrátám zvířat ze studie např. v důsledku kanibalismu, autolýzy tkání nebo chyb v obsluze. Moribundní zvířata by měla být utracena a pitvána.

Klinické příznaky včetně neurologických a očních nálezů a mortalita se zaznamenávají u všech zvířat. Zvláštní pozornost je třeba věnovat vývoji tumorů: doba objevení, lokalizace, rozměry, vzhled a progrese každého viditelného či hmatného tumoru se zaznamenává.

Je třeba provádět měření spotřeby potravy (a vody tam, kde je testovaná látka podávána v pitné vodě) týdně během prvních 13 týdnů a pak přibližně ve tříměsíčních intervalech, ledaže by zdravotní stav nebo změny tělesné váhy ukázaly nutnost jiné frekvence sledování.

Tělesné hmotnosti se zaznamenávají individuálně u všech zvířat jednou týdně během prvních 13 týdnů období testu a aspoň jednou za čtyři týdny po tomto období.

Hematologická vyšetření (např.obsah hemoglobinu, hematokrit, celkový počet erythrocytů, celkový počet bílých krvinek, krevních destiček, nebo další měření srážlivosti) by měla být prováděna za tři měsíce, šest měsíců a poté v přibližně šestiměsíčních intervalech, a na konci na vzorcích krve od 10 potkanů na pohlaví z každé skupiny. Tam kde je to možné, vzorky ve všech intervalech by měly být od týchž potkanů.

Pokud pozorování zvířat v klecích svědčí o zhoršeném zdravotním stavu zvířat během studia, je třeba vyšetřit diferenciální obraz bílých krvinek.

Diferenciální obraz bílých krvinek se provede ve vzorcích ze zvířat ve skupině s nejvyšší dávkou a u kontrol. Pokud tato data, nebo údaje z vyšetření patologických změn naznačí nutnost, diferenciál se vyšetří i u skupiny s dávkou nejblíže nižší, než je vysoká dávka.

Vzorky moči od 10 potkanů od každého pohlaví se sbírají pro analýzu pokud možno od stejných zvířat a ve stejných intervalech jako hematologické zkoušky. Následující stanovení jsou provedena buď na vzorcích jednotlivých zvířat nebo na směsném vzorku pro skupiny podle dávek a pohlaví:

V přibližně šestiměsíčních intervalech a na závěr jsou odebrány krevní vzorky pro biochemická měření od všech ne-hlodavců a 10 potkanů obojího pohlaví, pokud možno pro tytéž potkany ve všech intervalech. Od nehlodavců se vedle toho odeberou vzorky před testem. Z těchto vzorků je připravena plasma a jsou provedeny následující zkoušky:

Kompletní pitva se provede u všech zvířat, včetně těch, která zemřela během pokusu nebo byla utracena v moribundním stavu. Před utracením se odeberou vzorky krve všech zvířat pro diferenciální obraz bílých krvinek. Všechny viditelné léze, tumory nebo léze, nebo léze které by mohly být tumory, je třeba uchovat. Mělo by být provedeno porovnání anatomicko-patologických změn s mikroskopickými nálezy.

Všechny orgány a tkáně by měly být uchovány pro histopatologické vyšetření. To se obvykle týká následujících orgánů a tkání: mozku³ (prodloužené míchy/mostu, mozečkové kory, kory mozkové), podvěsku mozkového, štítné žlázy a příštítných tělísek, thymu, trachey a plic, srdce, aorty, slinných žlaz, jater³, sleziny, ledvin³, nadledvinek³, jícnu, žaludku, dvanácterníku, jejuna, ilea, slepého střeva, tračníku, konečníku, močového měchýře, lymfatických uzlin, slinivky, gonád³, akcesorních pohlavních orgánů, samičí mléčné žlázy, kůže, svaloviny, periferního nervu, míchy (krční, hrudní a bederní), sterna s kostní dření a stehenní kosti včetně kloubů, a očí. Naplnění plic a močového měchýře fixativem je optimální cestou ke konzervaci těchto tkání; naplnění plic v inhalačních studiích je zásadní pro odpovídající histopatologické zkoumání. Ve speciálních studiích, jako jsou inhalační studie, má být studován celý respirační trakt včetně nosu, hltanu a hrtanu.

Byla-li provedena jiná klinická vyšetření, informace získané z těchto procedur by měly být k disposici před mikroskopickým vyšetřením, protože mohou dát patologovi významné vodítko.

Pro testování chronické toxicity:

Podrobné vyšetření se provede ve všech uchovaných orgánech všech zvířat satelitní skupiny s vysokou dávkou a satelitní kontrolní skupiny. Pokud se v satelitní skupině exponované nejvyšší dávce najdou patologické změny způsobené látkou, vyšetří se histologicky cílové orgány všech ostatních zvířat z ostatních exponovaných satelitních skupin i ze všech exponovaných skupin části studie věnované karcinogenitě při jejím ukončení.

Pro testování karcinogenity:

Údaje se sumarizují ve formě tabulek, ukazujících pro každou testovanou skupinu počet zvířat na začátku testu, počet zvířat ukazujích tumory zjištěné během testu, dobu jejich stanovení a počet zvířat s tumory při utracení. Výsledky se hodnotí odpovídající statistickou metodou. Mohou být použity jakékoliv uznávané statistické metody.

Zpráva o testu bude, pokud možno, obsahovat následující informace:

Testovaná látka se podává několika skupinám samic a samců v odstupňovaných dávkách.

Samci dostávají testovanou látku v době růstu a alespoň v průběhu jednoho úplného spermatogenního cyklu (přibližně 56 dnů u myší a 70 dnů u potkanů), aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na spermatogenezu.

Samice rodičovské generace (P) dostávají látku po dobu alespoň dvou estrálních cyklů, aby byl zachycen jakýkoliv nepříznivý účinek testované látky na estrus. Zvířata jsou poté připuštěna. V době připouštění se testovaná látka podává zvířatům obou pohlaví, v době gravidity a kojení pouze samicím.

Pro inhalační aplikaci je třeba metodu modifikovat.

Před zahajením testu se zdravá mladá dospělá zvířata náhodně rozdělí do dvou skupin - kontrolní a exponované skupiny. Zvířata jsou chována nejméně 5 dnů před zahájením pokusu v těch podmínkách ustájení a krmení, v jakých budou během experimentu.

Doporučuje se testovanou látku podávat v potravě nebo v pitné vodě. Jiné způsoby podání jsou také přijatelné. Všechna zvířata látku dostávají stejným způsobem v průběhu celého testu. Pokud se používá k usnadnění aplikace vehikulum nebo jiné aditivum, musí být o nich známo, že nemají toxické účinky. Látka se aplikuje 7 dní v týdnu.

Dává se přednost potkanům nebo myším. Používají se zdravá zvířata, do té doby nepoužitá pro jiné experimenty. Nepoužívá se kmenů s nízkou plodností. Musí být plně charakterizována co do druhu, kmene, pohlaví a váhy a/nebo věku. Plodnost musí být ověřena vhodným způsobem u obou pohlaví. Zvířata v obou skupinách, exponované a kontrolní, musí být odstavena před zahájením aplikace.

Každá exponovaná i kontrolní skupina musí mít dostatečný počet zvířat, aby bylo zaručeno cca 20 březích samic s přibližně stejným termínem porodu. Cílem je získat dostatečný počet těhotenství a potomstva, a tím zajistit spolehlivé hodnocení vlivu látky na plodnost, průběh gravidity a mateřské chování v P generaci, kojení, růst a vývoj potomstva generace F₁ od početí do odstavu.

Vodu a potravu dostávají zvířata ad libitum. Před porodem se těhotné samice přemístí do zvláštních porodních nebo mateřských klecí a je jim poskytnut materiál pro vytvoření hnízda.

Použijí se alespoň tři exponované skupiny a jedna kontrolní. Pokud se používá pro aplikaci testované látky vehikulum, pak zvířata kontrolní skupiny dostávají vehikulum v nejvyšším použitém objemu. Pokud testovaná látka snižuje příjem a využití potravy, je třeba uvážit použití další kontrolní skupiny, spárované co do výživy.

Testovaná látka v nejvyšší koncentraci má v ideálním případě - pokud to není omezeno jejími fyzikálně-chemickými vlastnostmi nebo povahou biologického účinku - vyvolávat toxicitu, ale žádná uhynutí v rodičovské populaci. Střední dávka(y) by měla(y) vyvolat minimální toxické účinky, které by se daly připsat testované látce, a nejnižší dávka by neměla vyvolávat žádné pozorovatelné nepříznivé účinky, ani u rodičů ani u potomstva.

Při podání sondou nebo v tobolkách se dávka stanoví individuálně na základě hmotnosti zvířete a přizpůsobuje se každý týden podle změny váhy. V případě těhotných samic dávky mohou být případně určeny na základě tělesné hmotnosti v 0. nebo 6.dni od začátku těhotenství.

V případě látek s nízkou toxicitou, pokud se ani dávka 1000 mg.kg^-1 neprojevuje žádným toxickým účinkem na reprodukci, nemusí se provádět studie na jiných dávkových úrovních. Pokud předběžná studie ukáže, že vysoká dávka, vyvolávající u matek jasné příznaky toxicity, nemá nepříznivé účinky na plodnost, není nutné provádět studie na jiných dávkových úrovních.

Denní aplikace samcům rodičovské generace (P) začne ve věku pěti až devíti týdnů, po nejméně pětidenní aklimatizaci po odstavení. U potkanů aplikace pokračuje deset týdnů před obdobím připouštění (8 týdnů pro myši). Samci se buď utratí a vyšetří na konci období připouštění, nebo se pokračuje v aplikaci a mohou být použiti pro produkci dalších vrhů a jsou pak utraceni a vyšetřeni někdy před koncem pokusu.

Denní aplikace samicím rodičovské generace (P) začne po pětidenní aklimatizaci a pokračuje aspoň dva týdny před obdobím připouštění. Denní aplikace pokračuje pak po celé tři týdny období připouštění, v době gravidity až do odstavení F₁ generace. Je přípustná změna dávkovacího plánu podle znalostí o vlastnostech studované látky, např. o indukci metabolismu a/nebo bioakumulaci.

Je možno použít párování 1:1 (jedna samice a jeden samec) anebo 1:2 (jeden samec ke dvěma samicím).

V případě 1:1 párovaní, samice se ponechá s týmž samcem ve společné kleci do otěhotnění anebo po dobu 3 týdnů. Každé ráno jsou samice vyšetřeny na přítomnost spermatu nebo vaginální zátky. Den 0 těhotenství je definován jako den nálezu vaginální zátky nebo spermatu.

Dvojice, u kterých nedojde k oplodnění, je třeba vyšetřit s cílem zjistit důvod neplodnosti páru. To je možné buď poskytnutím další příležitosti k oplodnění s osvědčenými jedinci obou pohlaví nebo mikroskopickým vyšetřením reprodukčních organů nebo vyšetřením estrálního cyklu a spermatogenezy.

Zvířatům použitým pro vyšetření plodnosti je ponechána možnost porodit normálně a pečovat o své potomstvo do okamžiku odstavení bez standardizace velikosti vrhů. Pokud se velikost vrhů standardizuje, je třeba dodržet následující postup: mezi 1. a 4. dnem po porodu se velikost všech vrhů upraví vyřazením nadbytečných jedinců tak, aby se dosáhlo počtu 4 samců a 4 samic na vrh; pokud to není proveditelné, je možno standardizovat na jiné počty, např. 5 samců a 3 samice. Vrhy menší než 8 nelze standardizovat.

Každé zvíře má být pozorováno alespoň jednou za den. Významné změny chování, příznaky ztíženého nebo prodlouženého porodu, a všechny příznaky toxicity, včetně mortality, se zaznamenávají. Příjem potravy se měří denně jak před tak během doby připouštění. Během gravidity je vhodné kontrolovat příjem potravy denně. Po porodu a v průběhu laktace se měří příjem potravy (a vody, pokud se látka podává v pitné vodě) ve stejný den, kdy je potomstvo váženo. Rodičovská P zvířata se váží první den aplikace a pak týdně. Všechna pozorování se zaznamenávají individuálně pro každé dospělé zvíře.

Doba gestace se počítá od dne 0 těhotenství. Každý vrh se co nejdříve po porodu vyšetří a stanoví se počty a pohlaví mláďat, počet mrtvých a živých porodů a přítomnost hrubých anomalií.

Mrtvá mláďata a mláďata utracená ve čtvrtém dnu se uchovají pro vyšetření na možné defekty. Živá mláďata se spočítají a celé vrhy se zváží ráno po porodu, ve 4. a 7.dnu a potom každý týden do ukončení studie, kdy jsou zvířata zvážena individuálně. Pozorují se a zaznamenávají všechny abnormality v chování a fyzickém stavu matek a potomstva.

Po utracení nebo úmrtí se všechna zvířata generace P makroskopicky vyšetří na strukturní abnormality anebo patologické změny, se zvláštní pozorností k orgánům reprodukčního systému. Mlaďata zemřelá nebo umírající se vyšetří na defekty.

Vaječníky, děloha, děložní hrdlo, vagina, varlata, epididymis, semenné váčky, koagulační žláza, prostata, hypofysa a cílové orgány všech zvířat generace P se uchovají pro mikroskopické vyšetření. V případě, že tyto orgány nebyly doposud vyšetřeny v jiných mnohadávkových studiích, provede se mikroskopické vyšetření u všech zvířat kontrolní skupiny a skupiny dostávající nejvyšší dávku a dále u zvířat, která zemřela v průběhu pokusu.

Orgány, které jevily abnormality u těchto skupin zvířat, se vyšetří i u P zvířat ostatních dávkových skupin. V těchto případech se mikroskopicky vyšetřují všechny tkáně makroskopicy postižené. Jak již bylo uvedeno, reprodukční orgány zvířat podezřelých z neplodností se mají též podrobit mikroskopické analýze.

Data se sumarizují v tabulkách, kde je uveden pro každou dávkovou skupinu počet zvířat na začátku pokusu, počet plodných samců, počet těhotnývh samic, typ změn a procento zvířat nesoucích tyto změny.

Numerické výsledky mají být statisticky zpracovány příslušnou statistickou metodou. Může se použít kterákoliv obecně přijímaná statistická metoda.